湖南大学生物化学真题答题(大题,须稍加整理)(12)

本站小编免费考研网/2016-01-10

的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天
然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA
结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中
复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克
隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达
体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。
常用的工具酶
有多种方法可获得目得基因
1.构建cDNA文库分离目的基因
过程：
（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的
第一条链。
（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条
链。
（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。（4）接头或衔接子连接。
（5）凝胶过滤分离cDNA。
（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。
2.人工化学合成法
适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、
磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。
过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成
为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退
火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。
3.利用PCR技术直接扩增目的基因
PCR
PCRPCR
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，
已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需
的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的
cDNA链，用于重组、克隆。
1.载体的选择（以质粒为例）
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小，拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
(6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别
(7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
(8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而
不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。
(9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌
体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA
却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，
而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上
清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
构建基因表达载体

1.用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。
2.用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一
个重组DNA分子（重组质粒）。
目的基因导入受体细胞

1.将目的基因导入植物细胞－农杆菌转化法
2.将目的基因导入动物细胞－显微注射法
3.将目的基因导入微生物细胞（以大肠杆菌为例）
（1）用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周
围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下
促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
（3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，
在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
检测与鉴定

1.要检测目的基因是否插入转基因生物染色体的DNA上
检测方法：采用DNA分子杂交技术
2.检测目的基因是否转录了mRNA
检测方法：同样用分子杂交技术DNA与RNA杂交
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
检测方法：提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带，表明
目的基因已形成蛋白质产品。

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

乙酰辅酶A携带2个C进入三羧酸循环，期间经过两次脱羧，第一次(草酰琥珀酸到α-酮戊二酸)脱去的C来自乙酰辅酶A，但第二次(α-酮戊二酸到琥珀酰-CoA)脱去的C并不是来自于乙酰辅酶A，而是来自最初的草酰乙酸，因此循环之后形成的新的草酰乙酸带有一个14C，这个草酰乙酸进入葡糖异生路径生成葡萄糖，再合成糖原。

1、简述转录的基本过程.
①起始，RNA聚合酶全酶与DNA启动子结合，首先由σ因子识别DNA启动子的识别部位，核心酶则结合在启动子的结合部位，DNA双螺旋局部打开，暴露DNA模板链，RNA的合成原料NTP按照碱基互补原则定位进入模板链，在RNA聚合酶的催化下，第一个和第二个NTP之间形成3 ′，5′-磷酸二酯键，同时释放一个焦磷酸，当第一个磷酸二酯键形成后，σ因子脱落，起始阶段结束。
②延长、RNA聚合酶核心酶沿DNA模板链3′→5′滑动，每往前移动一个核苷酸距离，就有一个与模板互补的NTP进入反应体系，在RNA聚合酶的催化下，逐一地形成3′，5′-磷酸二酯键，使新合成的RNA分子不断延长。

12/20 首页上一页 10 11 12 下一页尾页

湖南大学生物化学真题答题(大题,须稍加整理)(12)

本站小编免费考研网/2016-01-10

相关话题/生物化学

领限时大额优惠券,享本站正版考研考试资料!

湖南大学2012年生物化学考研真题

湖南大学2005-2009生物化学考研真题

历年各大高校生物化学考研真题

2013南京师范大学生物化学628考研大题+答案

2012南京师范大学生物化学628考研大题+答案

吉林大学1989-2007年生物化学考研真题汇集

苏州大学生物化学考研题库

东北师范大学生物化学考研复习习题汇总

2014年南京农业大学801 生物化学考研试题(回忆版)

2015年南京农业大学生物化学801真题回忆版