第十二章 生物合成技术
1、解释盐析法沉淀蛋白质的基本原理？答：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。而当蛋白质在等电点处时，蛋白质不带电，溶解度小，当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1.RT-PCRRT-PCR是将RNA模板的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。
5.cDNA文库以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNA library)。与基因结DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这么分离的。
8.SD序列原核生物中每一个mRNA都具有其核糖体结合位点，它是位于AUG上游8～13个核苷酸外的一个富含嘌呤(GGAGGU)的短片段，称SD序列。这段序列正好与30S小亚基中的16srRNA3′端一部分富含嘧啶的序列互补，因此SD序列也叫做核糖体结合序列，这种互补就意味着核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来起始肽链的合成。真核生物无此序列。

(1)Southern blotting：用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的DNA，将其作为探针，与固定在膜上的DNA杂交，以检测膜上是否存在同源DNA分子。①基本操作：A限制性内切酶消化基因组DNA；B琼脂糖凝胶电泳；C变性；D将凝胶中的变性DNA区带转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上；E封阻剂封闭非特异性位点；F加入探针杂交；G放射自显影、免疫反应或其他方法检测杂交区带。②应用：主要用于基因组DNA的分析，例如基因组中特异基因的定位和检测。
(2)Northern blotting：用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的DNA或者RNA，将其作为探针，与固定在膜上的RNA杂交，以检测膜上是否存在同源RNA分子。基本操作类似Southern blotting，但是再转移前不需要进行酶切。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，及对不同组织细胞的表达水平进行比较。本方法检测mRNA的灵敏性没有RT-PCR好，但是专一性好，假阳性率低。
(3)Western blotting：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，用电转移到固相支持物上(常用NC膜)，然后可进行染色。染色有直接法和间接法二种，常用间接免疫染色法。首先用抗靶蛋白的非标记特异性抗体与NC膜反应，经适当洗涤后，与抗原结合的抗体可以和用碱性磷酸酶、过氧化物酶或同位素标记的第二抗体反应，然后进行显色。用于检测样品中特异性蛋白质的存在、蛋白质半定量分析，以及蛋白质分子间相互作用的研究。Western blotting只能用电转移，而上两种方法可以用毛细法、电转移、真空吸引转移法。

原理
  Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
操作步骤
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
（四）免疫反应：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。
3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。
6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。
7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
四、注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA
技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞
中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而
创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学