9．光学显微镜能达到的最大有效放大倍数是        ，这时一般使用        X的目镜，和        x的物镜，并应在物镜镜头和玻片之间加        。
10．采用明视野显微镜观察未经染色的标本(如活的细胞)时，        光的          和           都没有明显的变化，因此，其形态和内部结构往往难以分辨。
11．在         的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。
12．透射电子显微镜用电子作为          ，因此其分辨率较光学显微镜有很大提高，但镜筒必须是    环境，形成的影像也只能通过         或         进行观察、记录。
13．在显微镜下不同细菌的形态可以说是千差万别，丰富多彩，但就单个有机体而言，其基本形态可分为         、         与         3种。
14．霉菌菌体均由分支或不分支的菌丝构成。许多菌丝交织在一起，称为        。在固体培养基上，部分菌丝伸入培养基内吸收养料，称为        ；另一部分则向空中生长，称为        。有的气生菌丝发育到一定阶段，分化成        。
15．          是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力，并进行吞噬营养的单细胞真核生物。它们个体微小，大多数都需要显微镜才能看见。
选择题（4个答案选1）
    1．培养微生物的常用器具中，(    )是专为培养微生物设计的。
    A平皿    B试管    C烧瓶    D烧杯
    2．(    )可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
    A选择平板    B富集培养    C稀释涂布    D单细胞显微分离
    3．下面哪一项不属于稀释倒平板法的缺点?(    )
A菌落有时分布不够均匀B热敏感菌易被烫死 C严格好氧菌因被固定在培养基中生长受到影响 D环境温度低时不易操作
    4．下面哪一种方法一般不被用作传代保藏?(    )   
    A琼脂斜面    B半固体琼脂柱  C培养平板    D摇瓶发酵
    5．冷冻真空干燥法可以长期保藏微生物的原因是微生物处于(    )的环境，代谢水平大大降低。
    A干燥、缺氧、寡营养     B低温、干燥、缺氧    C低温、缺氧、寡营养    D低温、干燥、寡营养
6．对光学显微镜观察效果影响最大的是(    )。  A目镜    B物镜    C聚光器    D总放大倍数
7．暗视野显微镜和明视野显微镜的区别在于(    )。A目镜    B物镜    C聚光器    D样品制备
8．相差显微镜使人们能在不染色的情况下，比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是因为它改变了样品不同部位间光的(    )，使人眼可以察觉。
  A波长    B颜色    C相位    D振幅
9．(    )不是鉴别染色。A抗酸性染色    B革兰氏染色    C活菌染色    D芽孢染色
10．细菌的下列哪项特性一般不用作对细菌进行分类、鉴定?(    )
  A球菌的直径    B球菌的分裂及排列  C杆菌的直径    D杆菌的分裂及排列
是非题
1．为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，并在使用前进行高温干热灭菌。
2，所有的微生物都能在固体培养基上生长，因此，用固体培养基分离微生物的纯培养是最重要的微生物学实验技术。
3．所有的培养基都是选择性培养基。
4．直接挑取在平板上形成的单菌落就可以获得微生物的纯培养。
5．用稀释摇管法分离获得的微生物均为厌氧微生物。
6．冷冻真空干燥保藏、液氮保藏法是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用这两种方法作为主要的微生物保存手段。
7．光学显微镜的分辨率与介质折射率有关，由于香柏油的介质折射率(约1．5)高于空气(1．0)，  因此，使用油镜的观察效果好于高倍镜，目前科学家正在寻找折射率比香柏油更高的介质以进一步改善光学显微镜的观察效果。
8．与其他电子显微镜相比，扫描隧道显微镜在技术上的最大突破是能对活样品进行观察。
9．与光学显微镜相比，电子显微镜的分辨率虽然有很大的提高，但却无法拍摄彩色照片。
10．和动植物一样，细菌细胞也会经历由小长大的过程，因此，在相同情况下应选择成熟的细菌而非幼龄细菌进行显微镜观察，这样可以看得更清楚。
11．霉菌、酵母菌均是没有分类学意义的普通名称。
问答题
1．一般说来，严格的无菌操作是一切微生物工作的基本要求，但在分离与培养极端嗜盐菌时常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到影响，你知道这是为什么吗?
2．如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验?
3．为什么光学显微镜的目镜通常都是15X?是否可以采用更大放大倍率的目镜(如30x)来进 一步提高显微镜的总放大倍数?
4．为什么透射电镜和扫描电镜对样品厚度与大小的要求有如此大的差异?能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的表面结构?
5．试论电子显微镜在进行生物样品制备与观察时应注意的问题。
6．对细菌的细胞形态进行观察和描述时应注意哪些方面?你是否能很快地在显微镜下区分同为单细胞的细菌、酵母菌和原生动物?
三、习题解答
填空题    1．个  群    2．纯    3。灭菌  任何生物    4．稀释倒平板法  涂布平板法  平板划线法    5．分类  鉴定    6．死亡  污染  变异    7．低(高)  好(差)    8．放大  反差  分辨率   9．1 000～1 500x  10或15  90或100  香柏油    10．’波长  振幅    11．紫外线    12．光源  真空  荧光屏  照片    13．球状  杆状  螺旋状    14．菌丝体  营养菌丝  气生菌丝   繁殖菌丝    15．原生动物
选择题   1．  A    2．  B    3．  A    4．  D    5．  B    6．  B    7．  C    8．  D    9．  C    10．  D
是非题  错错对错错 对错对对错 对
问答题
    1．培养极端嗜盐菌的培养平板需要添加很高浓度的氯化钠(25％)，实验室环境中的一般微生物都不能在这种选择培养基上生长，因此在实验过程中即使不采取无菌操作技术，实验结果仍不会受到影响。
    2．（1）根据选择分离的原理设计不含氮的培养基，在这种培养基上生长的细菌，其氮素应来自固氮作用。（2）将环境样品(例如土样)稀释涂布到选择平板上，放置于厌氧罐中。对厌氧罐采用物理、化学方法除去氧气，保留氮气。培养后在乎板上生长出来的细菌应是厌氧固氮菌或兼性厌氧固氮菌。（3）挑取一定数量的菌落，对应点种到两块缺氮的选择平板上，分别放置于厌氧罐内、外保温培养。在厌氧罐内外均能生长的为兼性厌氧固氮菌，而在厌氧罐外的平板上不生长，在厌氧罐内的平板上生长的即为可能的厌氧固氮菌。（4）对分离得到的厌氧固氮菌菌落样品进行系列稀释，涂布于相应的选择平板，重复上述步骤直到获得厌氧固氮菌的纯培养。
3．光学显微镜的分辨率受到光源波长及物镜性能的限制，在使用最短波长的可见光(4．50nnl)作为光源时在油镜下可以达到的最大分辨率为0．18 μm。由于肉眼的正常分辨能力一般为    0．25mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到1 000～1 500倍。油镜的放大倍数是100x，因此显微镜配置的目镜通常都是15 x，选用更大放大倍数的目镜(如30 x)进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。
    4．（1）透射电子显微镜的成像原理类似于普通光学显微镜，作为光源的电子束在成像时要穿透样品。由于电子束的穿透力有限，因此在进行透射电镜观察时要求样品一定要薄。而扫描电镜的成像原理类似于电视或电传真照片，图像是通过收集样品表面被激发的二次电子形成的，因此对样品的厚度并无特别的要求。（2）扫描电镜一般被用于观察样品的表面结构，但通过样品制备过程中的冰冻蚀刻技术，用扫描电镜也可观察到样品的内部结构，获得立体的图像。（3）透射电镜一般通过超薄切片技术观察样品的内部结构，但通过样品制备过程中的复型技术，用透射电镜也可对样品的表面结构进行观察。
5．（1）电子束的穿透能力：电子束的穿透能力是十分有限的，超薄切片是基本的透射电镜实验技术。相比之下，扫描电镜对样品的大小和厚度没有严格的要求。（2）生物组织的特点：生物组织的主要成分之一是水，若生物样品不经处理直接放进电镜，镜筒中的高真空必然会使样品发生严重的脱水现象，失去样品原有的空间构型，所以一般都不能用电镜进行生物样品的活体观察。而且，由于生物样品很容易遭到破坏，在对样品进行固定、干燥、染色及其他一些处理过程中，也必须随时注意使样品尽量保持生活状态下的精细结构，而不严重失真。另外，在扫描电镜的使用中，除要求样品干燥外，还需要样品具一定的导电能力，以减少样品表面电荷的堆积并得到良好的二次电子信号。而生物样品一般都是不导电的，所以在制备扫描电镜生物样品时，一般需在其表面镀上一层金属薄膜。（3）增加样品的反差：显微观察时，只有样品具有一定的反差，才能得到清晰的图像。光学显微镜可以通过各种染色技术来增加样品的反差，并得到彩色的样品图像。而在电镜的使用中，彩色染料是不采用的，因为两种不同的颜色在电镜中是不能区别的。电镜中生物样品不同结构之间反差的取得一般是用重金属盐染色或喷镀，凡是嗜金属的结构，对电子的散射与吸收的能力增强，易于形成明暗清晰的电子图像。而且，由于电子图像是靠不同电子密度形成的亮度差异而构成，所以，电镜得到的电视或照相图像都是黑白的。
6．（1）首先应使用稀释涂布等方法对待检菌株的纯度、群落形态、生理特性等进行检查、确认。（2）选用正常的新鲜培养基和新鲜培养物进行培养和观察，避免培养过程中一些物理、化学条件的改变或培养时间过长等因素对细胞形态的影响。（3）报告细胞大小时应选用多个细胞检测的平均数，并记录所用的实验方法，包括培养条件、培养时间、样品制备方法和染色方法等。（4）可从大小和形态上对细菌、酵母菌和原生动物进行区分。酵母菌、原生动物个体较大，一般可用低倍镜观察，酵母菌细胞一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形，不具运动性，原生动物细胞形态多变，能够运动。相比较而言，细菌细胞一般较小，需用高倍镜或油镜才能看清。
 附：显微镜种类比较
显微镜类型    基本原理及特点    应    用
光学显
微镜    明视野显微镜    光线透射照明，物像处于亮背景中。为光学显
微镜的最基本配置，价格便宜、容易使用    各种情况下染色样品或活细胞个体形态的观察
    暗视野显微镜     通过特殊的聚光器实现斜射照明，亮物像形成于暗背景中    明视野显微镜下不易看清的活细胞的观察；不易被染色或易被染色过程破坏的细胞的观察(例如对梅毒密螺旋体的检测)；观察活细胞的运动性
    相差显微镜    通过特殊的聚光器和物镜提高样品不同部位间的反差(明暗差异)     活细胞及其内部结构的观察
    荧光显微镜    经荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线照射下激发出各种波长的可见光，在黑暗
的背景中形成明亮的彩色物像    环境微生物的直接观察；病灶或医学样品中特定病原微生物的直接检测(使用特定的荧光抗体)
    共聚焦显微镜    激光作为光源，每次照明样品的一个点，连续
扫描后经计算机处理获得样品的二维或三维
图像。显微镜价格昂贵     对完整细胞的细微立体结构进行观察
和分析
电子显微镜    透射电镜    用电子束作为“光源”聚焦成像，分辨率较光学显微镜大大提高。仪器庞大、昂贵、对工作环境和操作技术有较高要求     对病毒颗粒或超薄片处理后对细胞
的内部结构进行观察
    扫描电镜    电子束在样品表面扫描，收集形成的二次电子形成物像。分辨率远高于光学显微镜。仪器庞大、昂贵、对工作环境和操作技术有较高要求    一般用于观察样品的表面立体结构
探针扫描显微镜    隧道扫描显微镜    用细小的探针在样品表面进行扫描，通过检测针尖和样品间隧道效应电流的变化形成物像     与电子显微镜相比，这类显微镜能提供
    原子力显微镜    利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描，同时通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的
信息    更高的分辨率，可在生理状态下对生物大分子或细胞结构进行观察。同时仪器体积较小，价格也相对便宜
 
项 目      形  态        构  造        数  量        功  能
 内质网    囊腔，细管形    有膜。分两种：糙面内质网的膜上有核糖体粒，光面内质网的膜上无核糖体粒     数量少     糙面内质网合成、运送蛋白质，光面内质网合成磷脂
 核糖体    小颗粒状     无膜。表层为蛋白质，内芯为RNA    数量极多，变化大    合成蛋白质
 高尔基体    扁平膜囊和小囊泡    有膜。由数个扁平膜囊和大小不等
的囊泡组成     数量少    浓缩蛋白质，合成糖蛋白和脂蛋白，协调细胞内环境
 溶酶体     球形小•囊泡    有膜。小囊泡内含数十种酸性水解酶    数量较多，但变化大     执行细胞内的消化功能
 微体     球形小囊泡    有膜。小囊泡内含氧化酶和过氧化
氢酶等    数量较多，但变化大     对脂肪酸进行氧化
 线粒体     杆菌状或囊状    有内外两层膜。内膜可形成嵴，其上有大量的基粒(ATP酶复合体)。基质内含TCA酶系、70S核糖体和双链环状DNA     数量多，但变化大     对底物进行氧化磷酸化以产生ATP
 叶绿体     
扁球状或扁椭圆状    由内、外两层膜以及类囊体和基质构成。基质内含70 S核糖体和双链环状DNA等。类囊体数量多，常叠成基粒    仅存在于光合生物中。不同细胞中数量变化很大    利用CO：和H：O进行光合作用，以合成葡萄糖和释放氧
第三章 微生物细胞的结构与功能
一、术语或名词
1．原核生物(proksryotes)  一大类细胞微小、只有称作核区(无细胞膜包裹的裸露DNA)的原核单细胞生物。所有原核生物都是微生物，包括真细菌和古生菌两大类群。原核生物与真核生物的主要区别是：①基因组由无核膜包裹的双链DNA环组成。②缺少单位膜分隔而成的细胞器。③核糖体为70S型。
2．细菌细胞壁(ceUWaU ofbacteris)  位于细菌细胞最外面的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖组成，有固定细胞外形和保护细胞免受损伤等多种功能。革兰氏阳性细菌细胞壁的特点是厚度大(20—80rim)和化学组分简单，一般只含90％肽聚糖和10％磷壁酸。革兰氏阴性细菌的细胞壁由外膜(含脂多糖、磷脂和外膜蛋白)和一薄层肽聚糖(2～3am)组成。
3．肽聚糖(peptidoglycan)  真细菌细胞壁的特有成分，由无数肽聚糖单体以网状形式交联而成。肽聚糖单体由肽与聚糖两部分构成，其中的肽由四肽尾和肽桥构成，聚糖则由N—乙酰葡糖胺和／V—乙酰胞壁酸以"—1，4糖苷键相互间隔交联而成，呈长链骨架状。C’细菌的四肽尾一般由L—Ala、D—Glu、L—Lys和D—Ala 4个氨基酸构成，肽桥则由5个Gly残基构成；C—细菌的四肽尾一般由L—Ala、D—Glu、m—DAP和D—Ala构成，且无肽桥。
4．磷壁酸(teichoicacid)  G’细菌细胞壁上的一种酸性多糖，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。可分壁磷壁酸和膜磷壁酸两种，前者是与肽聚糖分子间进行共价结合的磷壁酸，后者则是跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的磷壁酸。
5．外膜(outer membrane)  位于G—细菌细胞壁最外层的一层由脂多糖(LPS)、磷脂、脂蛋白和其他蛋白组成的厚膜。
6．脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)  位于C—细菌细胞壁最外层的一层较厚(8—10nm)的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖和O—特异侧链3部分构成，是C—细菌致病物质内毒素的成分。
7．外膜蛋白(outer membrane protein)嵌合在C—细菌细胞壁外膜上的多种蛋白质成分，如脂蛋白和孔蛋白等。
8．周质空间(periplasmicspace)  一般指位于C—细菌细胞壁外膜与细胞膜之间的狭窄空间，呈胶状，内含各种周质蛋白，包括各种酶类和受体蛋白等。
9．假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)  甲烷杆菌属(Methanobacterium)等部分古生菌细胞壁的主要成分。其多糖骨架由N—乙酰葡糖胺和N—乙酰塔罗糖胺糖醛酸以"—1，3糖苷键交替连接而成，连在后一氨基糖上的肽尾由L—Glu、L—Ala和L—Lys 3个L型氨基酸组成，肽桥则由L—Gin一个氨基酸组成。
10．缺壁细菌(cellwalldeficientbacteria)  细胞壁缺乏或缺损的各种细菌的统称，包括支原体、L型细菌、原生质体和球状体等。
11．L型细菌(1 form ofbacteria)  指在实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷菌株。因最初发现的念珠状链杆菌(Streptobacillus monil扣rmis)是在英国Lister研究所发现，故称L型细菌。
12．原生质体(protoplast)  在人为条件下，用溶菌酶除尽细菌等微生物原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁合成后，所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状细胞，一般由C’细菌形成。原生质体对渗透压敏感，无繁殖能力，在合适条件下，细胞壁可再生，并恢复其繁殖能力。
13．球状体(sphaeroplast)  又称原生质球，指还残留有部分细胞壁的原生质体。G—细菌一般只形成球状体。
14．细菌细胞质膜(cytoplasmic membrane Ofbacteria)  又称细菌细胞膜。是紧贴在细菌细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约?～8nm，由磷脂(占20％-30％)和蛋白质(占50％～70％)组成。细胞质膜的主要功能是选择性的控制细胞内外的物质交流。
15．间体(mesosome)  细菌细胞中的一种由细胞质膜内褶而形成的囊状构造，其中充满着层状或管状的泡囊。多见于G’细菌。每个细胞含一至几个。其功能与DNA的复制、分配，细胞分裂和酶的分泌有关。
16. 细菌的细胞质(cytoplasm ofbacteria)  细菌细胞质膜包围的除核区以外的一切半透明  胶状、颗粒状物质的总称。主要成分为颗粒状内含物，核糖体、酶类、中间代谢物、质粒、各种营养牧和大分子的单体等。
17．细菌的内含物(inclusionbody ofbacteria)  细胞质内形状较大的颗粒和泡囊状构造，包括各种贮藏物、羧酶体、气泡或磁小体等。
18．聚—β—羟丁酸(poly—β hydroxybutyrate，PHB)  存在于某些细菌细胞质内的颗粒状内含物，由许多羟基丁酸分子聚合而成，具贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。
19．异染粒(metachromaticgranules)  又称迂回体或捩转菌素，是无机偏磷酸盐的聚合物，具有贮藏磷元素和能量的功能。在白喉棒杆菌和结核分枝杆菌中易见到异染粒。
20．羧酶体(carboxysome)  存在于一些自养细菌细胞内的多角形或六角形内含物，内含1，5—二磷酸核酮糖羧化酶，在自养细菌的CO2：固定中起着关键作用。
21．．核区(nuclear region)  又称核质体，指原核生物所特有的无核膜结构、无固定形态的原始细胞核。其成分是一个大型环状双链DNA分子，它是细菌负载遗传信息的主要物质基础。
22．芽孢(endospore)  某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性(抗热、化学药物、辐射等)极强的休眠体。产芽孢的细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)两属。
23．渗透调节皮层膨胀学说(osmoregulatory expanded cortex theory)  解释芽孢耐热机制的一个较新的学说。它认为芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，从而使皮层产生极高的渗透压去夺取芽孢核心中的水分，其结果导致皮层的充分膨胀，而作为芽孢的生命部分——芽孢核心的细胞质却发生高度失水，并由此变得高度耐热了。
24．伴孢晶体(parasporalcrystal)  苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体(6内毒素)，称为伴孢晶体。它对约200种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用，故可制成细菌杀虫剂。
25．糖被(glycocalyx)  指包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。糖被有数种：①形态固定、层次厚的为荚膜。②形态固定、层次薄的为微荚膜。③形态不固定、结构松散的为黏液层。④包裹在细胞群体上有一定形态的糖被称菌胶团。糖被的主要功能是保护菌体免受干旱损伤或被宿主免疫活性细胞吞噬。