差速离心方法：

第七章．细胞的能量转换——线粒体和叶绿体

一、知识点：

构象偶联假说：

（1）ATP酶利用质子动力势，产生构象的改变，改变与底物的亲和力，催化ADP形成ATP；

（2）F1具有三个催化位点，但在特定的时间，三个催化位点的构象不同，因而与核苷酸的亲和力不同。在L构象，ADP、Pi与酶疏松结合在一起；在T构象，ADP、Pi与酶紧密结合在一起，在这种情况下可将两者加合在一起；在O构象，ATP与酶的亲和力很低，被释放出去。

（3）质子通过F0时，引起c亚基构成的环旋转，从而带动γ亚基旋转，由于γ亚基的端部是高度不对称的，它的旋转引起β亚基3个催化位点构象的周期性变化（L、T、O），不断将ADP和Pi加合在一起，形成ATP。

化学渗透假说：

当电子沿呼吸链传递时，所释放的能量将质子从内膜基质侧泵至膜间隙，由于线粒体内膜对离子是高度不通透的，从而使膜间隙的质子浓度高于基质，在内膜的两侧形成pH梯度及电位梯度，两者共同构成电化学梯度，即质子动力势。质子沿电化学梯度穿过内膜上的ATP酶复合物流回基质，使ATP酶的构象发生改变，将ADP和Pi合成ATP。

二、名词解释：

类囊体：是叶绿体内单层膜围成的扁平小囊，沿叶绿体的长轴平行排列。膜上含有光合色素和电子传递链组分，又称光合膜。许多类囊体叠在一起构成基粒，组成基粒的类囊体，叫做基粒类囊体，构成基粒片层。贯穿在两个或两个以上基粒之间的没有发生垛叠的类囊体称为基质类囊体，或基质片层。

三、简答论述：

为什么说线粒体和叶绿体是半自主细胞器？

（一）线粒体的半自主性

1963年Nass发现线粒体DNA（mtDNA），之后发现了RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体、氨基酸活化酶等进行DNA复制、转录和蛋白质翻译的全套装备。

线粒体能合成蛋白质，但是合成能力有限。线粒体1000多种蛋白质中，自身合成的仅十余种。线粒体的核糖体蛋白、氨酰tRNA合成酶等许多结构蛋白都是核基因编码，在细胞质中合成后，定向转运到线粒体的，因此称线粒体为半自主细胞器。

mtDNA表现为母系遗传，其突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。有些遗传病，如Leber遗传性视神经病、肌阵挛性癫痫等均与线粒体基因突变有关。

（二）叶绿体的半自主性

叶绿体DNA最早发现于衣藻叶绿体。ctDNA呈环状，基因组的大小因植物而异。

叶绿体只能合成自身需要的部分蛋白质，其余的是在细胞质游离的核糖体上合成运送到叶绿体的。

比较线粒体和叶绿体在结构上的异同：

线粒体的精细结构及其标志酶：

线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区域。

1.外膜

线粒体外膜含40%的脂类和60%的蛋白质，具有孔蛋白（porin）构成的亲水通道，标志酶为单胺氧化酶。

2.内膜

线粒体内膜含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于3：1。通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。内膜向线粒体基质褶入形成嵴，嵴能显著扩大内膜表面积（达5-10倍），嵴有板层状和管状两种类型。嵴上覆有基粒，基粒由头部（F1偶联因子）和基部（F0偶联因子）构成。线粒体氧化磷酸化的电子传递链位于内膜，内膜的标志酶为细胞色素C氧化酶。

3.膜间隙

线粒体膜间隙是内外膜之间的腔隙，延伸至嵴的轴心部，腔隙宽约6-8nm。由于外膜具有大量亲水孔道与细胞质相通，因此膜间隙的pH值与细胞质的相似。标志酶为腺苷酸激酶。

4.基质

线粒体为内膜和嵴包围的空间。除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中。标志酶为苹果酸脱氢酶。

什么是亚线粒体颗粒？

详细叙述ATP合成酶的结构：

ATP合成酶，分子量500KD，分为球形的F1（头部）和嵌入膜中的F0（基部），它可以利用质子动力势合成ATP，也可以水解ATP，转运质子。每个肝细胞线粒体通常含15000个ATP合酶、每个酶可产生100个ATP/s。

F1由5种多肽组成α3β3γδε复合体，具有三个ATP合成的催化位点（每个β亚基具有一个）。α和β单位交替排列，状如桔瓣；γ贯穿αβ复合体（相当于发电机的转子），并与F0接触；ε帮助γ与F0结合；δ与F0的两个b亚基形成固定αβ复合体的结构（相当于发电机的定子）。

F0由三种多肽组成ab2c12复合体，嵌入内膜，12个c亚基组成一个环形结构，具有质子通道，可使质子由膜间隙流回基质。

详细说明内共生起源学说：

内共生起源学说认为线粒体和叶绿体分别来源与细菌和蓝藻，其证据主要有：

（1）基因组相似；

（2）蛋白质合成途径相似；

（3）外膜相近于真核细胞的内膜系统，内膜相似于细菌质膜；

（4）繁殖方式相似；

（5）线粒体和叶绿体能在其它类细胞中长期存在（自主性和共生性）；

（6）线粒体祖先可能来自反消化副球菌。

详细说明非共生起源学说：

第八章．细胞核与染色体

一、知识点：

巴氏小体：在哺乳动物细胞内如有两个X染色体（通常为雌性），则其中的一个染色体常表现为异染色质，称巴氏小体。

二、名词解释：

染色质：指细胞间期核内能被碱性染料(洋红、苏木精等)染色的纤细网状物质，现在是指真核细胞间期核中DNA、组蛋白、非组蛋白、以及少量RNA组成的一串念珠状的复合体。当细胞分裂时，核内的染色质便螺旋化形成一定数目和形状的染色体。

染色体：在细胞分裂时，能被碱性染料染色的线形结构。在原核细胞内，是指裸露的环状DNA分子。

组蛋白：与DNA非特异性结合，形成染色体的蛋白质。带正电荷，含精氨酸，赖氨酸，属碱性蛋白，其含量恒定，在真核细胞中组蛋白共有5种。

非组蛋白：染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结合蛋白。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、基因表达和染色体结构调节蛋白等。

有丝分裂：最常见的一种细胞分裂，分裂过程中出现纺锤丝，将一个细胞的整套染色体平均分到两个子细胞中，所以新形成的两个细胞在遗传物质上和原来的细胞相同。

减数分裂：在配子形成过程中发生的分裂，连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个细胞，每个细胞中只含有单倍数的染色体，即染色体数减少一半，所以叫做减数分裂。

核孔复合体：核孔是细胞核与细胞质之间物质交换的通道。细胞质中合成的核的蛋白，通过核孔输入细胞核，细胞核中合成的各类RNA、核糖体亚单位通过核孔运到细胞质。核孔由至少50种不同的蛋白质构成，称为核孔复合体。

核定位信号：核内含量丰富的核质蛋白的C端有一个信号序列，可引导蛋白质进入细胞核，称作核定位信号。

联会复合体：是同源染色体联会过程中形成的非永久性的复合结构，主要成分是碱性蛋白及酸性蛋白，由中央成分向两侧伸出横丝，使同源染色体固定在一起。

常染色质：进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染；易被核酸酶在一些敏感的位点降解。

异染色质：在间期核中处于凝缩状态，无转录活性，也叫非活动染色质，是遗传惰性区；在细胞周期中表现为晚复制、早凝缩，即异固缩现象。

染色单体：中期染色体由两条染色单体组成，两者在着丝粒的部位相互结合，每一条染色单体是由一条DNA 双链经过螺旋和折叠而形成的，到后期，着丝粒分裂，两条染色单体分离。

核型：是细胞分裂中期染色体的表型，包括染色体的数目、大小和形态特征等方面。如果将成对的染色体按形状、大小依顺序排列起来叫核型图。

染色体组型：通常指核型的模式图，代表一个物种染色体的模式特征。核型分析对于探讨人类遗传病的机制、物种亲缘关系与进化、远源杂种的鉴定等具有重要意义。

染色体显带技术：是经物理、化学因素处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定的深浅不同带纹的方法。

染色线：前期或间期核内的染色质细线，代表一条染色单体。

染色粒：前期染色体上呈线性排列的念珠状颗粒，是DNA 局部收缩形成的，异染色质的染色粒一般较大，而常染色粒的染色粒较小，在染色体上位于着丝粒两边的染色粒一般较大，而向染色体端部的染色体较小，呈梯度排列。

主缢痕：中期染色体上一个染色较浅而缢缩的部位，主缢痕处有着丝粒，所以亦称着丝粒区，由于这一区域染色线的螺旋化程序低，DNA 含量少，所以染色很浅或不着色。

动粒：

着丝粒和着丝点：是两个不同的概念，前者指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位，后者指主缢痕处两个染色单体外侧表层部位的特殊结构，它与纺锤体微管相接触。

次缢痕：除主缢痕外，染色体上第二个呈浅缢缩的部分称次缢痕，次缢痕的位置相对稳定，是鉴定染色体个别性的一个显著特征。

核仁组织区：染色体上除了着丝粒以外有时还有一缢痕，称为次级缢痕。在细胞分裂快结束时，出现的一个或几个核仁通常出现在次级缢痕的地方，所以又叫核仁形成区。是核糖体RNA 基因所在的区域，其精细结构呈灯刷状。能够合成核糖体的28S、18S 和5.8S rRNA。

随体：指位于染色体末端的球形染色体节段，通过次缢痕区与染色体主体部分相连。位于染色体末端的随体称为端随体，位于两个次缢痕中间的称中间随体。

端粒：是染色体端部的特化部分，其生物学作用在于维持染色体的稳定性。如果用X 射线将染色体打断，不具端粒的染色体末端有粘性，会与其它片段相连或两端相连而成环状。端粒由高度重复的短序列串联而成，在进化上高度保守。

端粒酶：一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在RNA为模板，把合成DNA的添加到染色体的3‘端。

灯刷染色体：这种染色体最早发现于卵母细胞减数分裂的双线期。由于染色体主轴两侧有侧环，状如灯刷，故名灯刷染色体。由两条同源染色体组成，在交叉处结合，每条同源染色体含2 条染色单体。轴上有一些染色粒，代表染色质紧密螺旋化的部位。同时两条染色单体向两边伸出许多侧环，侧环是RNA 活跃转录的区域。

多线染色体：存在于双翅目幼虫的唾腺细胞，染色体只复制，不分开，从而形成体积比普通染色体大1000-2000 倍、具有横带纹的巨大染色体。

绳珠模型：DNA、蛋白质纤丝的结构单位是核体，由8个组蛋白分子构成，DNA环绕在它的外面。核体与核体之间以一定距离相隔，成为一串珠子状。这种说明染色体细微结构的模型称为绳珠模型。

核纤层：位于内核膜的内表面，网络状，支持核膜。由核纤肽和中间纤维构成。

核骨架：是真核细胞内的真实结构体系；核骨架与中间纤维和核纤层构成贯穿核和质的网络状结构体系；核骨架主要是非组蛋白，含少量RNA；核骨架与DNA复制、基因表达及染色体的构建和包装密切相关；

三、简答论述：

核纤层的作用：

（1）保持核的形态

用高盐溶液、非离子去污剂和核酸酶去除大部分核物质，剩余的核纤层仍能维持核的轮廓；核纤层与核骨架以及穿过核被膜的中间纤维相连，使胞质骨架和核骨架形成一连续网络结构。

（2）参与染色质和核的组装

核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质（异染色质）在核周边锚定的位点。在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B型核纤肽与核膜残余小泡结合，A型溶于胞质中。在分裂末期，核纤肽去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。

核孔复合体的结构及其功能：

在电镜下观察，核孔呈圆形或八角形，主要包括以下几个部分：

（1）胞质环：位于核孔复合体胞质一侧，环上有8条纤维伸向胞质；

（2）核质环：位于核孔复合体核质一侧，上面伸出8条纤维，纤维端部与端环相连，构成笼子状的结构；

（3）转运器：核孔中央的一个栓状的中央颗粒；

（4）辐：核孔边缘伸向核孔中央的突出物。

核孔是细胞核与细胞质之间物质交换的通道，一方面核的蛋白都是在细胞质中合成的，通过核孔定向输入细胞核；另一方面细胞核中合成的各类RNA、核糖体亚单位需要通过核孔运到细胞质。此外注射实验证明，小分子物质能够以自由扩散的方式通过核孔进入细胞核。核孔是核质交换双向选择性亲水通道。核孔复合体是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，具有双功能、双向性。

染色体的类型及其特征：

根据着丝粒在染色体上的位置：

中部着丝粒染色体：着丝点在染色体中间，两臂长度相等。

亚中部着丝粒染色体：着丝点在染色体中间附近，两臂长度差不多。

近端部着丝粒染色体：着丝点在染色体端部附近，两臂长度相差很远。

端部着丝粒染色体：着丝点在染色体端部。

比较组蛋白与非组蛋白的特点及其作用。

染色质蛋白质主要负责DNA分子中遗传信息的组织、复制和阅读。

组蛋白：

组蛋白带正电荷，含精氨酸、赖氨酸，属碱性蛋白，其含量恒定，在真核细胞中组蛋白共有5种，分为高度保守的核心组蛋白（包括H2A、H2B、H3、H4）和可变的连接组蛋白（H1）两大类。

核心组蛋白的结构非常保守，核心组蛋白高度保守的原因可能有两个：（1）核心组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少；（2）在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二脂骨架都是一样的。

四种核心组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合，N端带正电荷的氨基酸向外伸出，与DNA分子结合，使DNA分子缠绕在组蛋白核心周围，形成核小体。尾部含有大量赖氨酸和精氨酸残基，为组蛋白翻译后进行修饰的部位，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。

H1不仅具有种属特异性，而且还有组织特异性，所以H1是多样性的。例如，在哺乳动物中组蛋白H1约有6种密切相关的亚型，氨基酸顺序稍有不同。

非组蛋白：

非组蛋白是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结合蛋白（凝胶迟滞电泳实验），包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、基因表达和染色体结构调节蛋白等。

非组蛋白的特性主要有：

（1）含有较多的天门冬氨酸、谷氨酸，带负电荷，属酸性蛋白质；

（2）整个细胞周期都进行合成，不象组蛋白只在S期合成，并与DNA复制同步进行；

（3）能识别特异的DNA序列，识别信息存在于DNA本身，位点在大沟部分，识别与结合靠氢键和离子键；

（4）具有多样性和异质性；

（5）具有多种功能，如帮助DNA分子折叠，形成不同的结构域，有利于DNA的复制和基因的转录，协助启动DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。

从DNA到染色体的包装过程：

（一）、染色体包装的多级螺旋模型

核小体：DNA螺旋缠绕组蛋白形成核小体，长度压缩了7倍，形成直径为10nm的纤维。

螺线管：电镜下可观察直径30nm的染色质纤维，纤维由核小体螺旋化形成，每6个核小体绕一圈，构成外径30nm、内径为10nm的中空管，长度压缩6倍。

超螺线管：直径0.4um的圆筒装结构，也称单位线，40倍。

染色体：超螺线管进一步螺旋折叠形成染色体，5倍。

（二）染色体的骨架－放射环结构模型

用高盐或硫酸匍聚糖加肝素处理染色体，电镜下看到一种网络状的染色体骨架结构，由骨架伸出无数DNA侧环。DNA酶消化后的骨架主要是非组蛋白，另外含有少量DNA和RNA。   认为30nm的纤维折叠为一系列的环结合在核骨架上（或称染色体骨架），结合点是富含AT的区域，这种环状的结构散布于细胞核中。

松解中期染色体可以见到螺旋结构，铺展电镜可以看到直径10nm和30nm的染色质纤维。但对中间层次的染色质结构还不清楚。

分析中期染色体的三种功能元件及其作用：

为确保染色体的复制和稳定遗传，染色体具有3个基本元素，即：自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(CEN) 和端粒序列(TEL)。

1、自主复制序列( ARS)

是DNA复制的起点。含有这一序列的质粒能高效转化宿主细胞，并能在细胞中独立于宿主染色体存在。

2、着丝粒序列(CEN)

CEN的都有两个彼此相邻的核心区，一个是80-90 bp的AT区，另一个是11 bp的保守区。CEN由大量串联的重复序列组成，其功能是参与形成着丝粒，使细胞分裂中染色体能够准确地分离。

3、端粒序列(TEL)

不同生物的端粒序列都由重复单位串联而成，人的重复序列为GGGTTA。真核细胞染色体端粒的重复序列不是染色体DNA复制时连续合成的，而是由端粒酶合成后添加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在RNA为模板，把合成DNA的添加到染色体的3‘端。

概述核仁的结构及其功能：

核仁没有界膜包围，在电子显微镜下可辨认出有3个特征性的区域，即：纤维中心(FC)，致密纤维组分(DFC)和颗粒组分(GC)。

纤维中心(FC)，是被致密纤维包围的一个或几个低电子密度的圆形结构，主要成分为RNA聚合酶和rDNA，这些rDNA是裸露的分子。

致密纤维组分(DFC)，呈环形或半月形包围FC，由致密的纤维构成，是新合成的RNP（指结合蛋白质的rRNA），转录主要发生在FC与DFC的交界处。

颗粒组分(GC)，由直径15-20 nm的颗粒构成，是正在加工、成熟的核糖体亚单位的前体颗粒。   核仁相随染色质分为两部分，一部分位于核仁周围，称为核仁周染色质，属异染色质，一部分位于核仁内，为常染色质，即核仁组织区，是rDNA所在的位置。

核仁的主要功能是核糖体的生物发生，包括rRNA的合成、加工和核糖体的亚单位的装配。

⑴、rRNA基因转录的形态和组织特征

   1964年Miller的电境铺展照片及后来的研究证明，rRNA的基因转录呈“圣诞树”样的结构。真核生物中rRNA基因有100-5000个拷贝，串联成重复序列。人单倍体基因组含200个rRNA基因拷贝，成簇分布在5条不同的染色体上。 rRNA基因由RNA聚合酶I负责转录，可以在一个转录单位连续工作。

⑵、rRNA前体的加工

     RNA聚合酶转录产生的初始转录产物为rRNA前体。哺乳类的rRNA前体为45S，果蝇的为38S，酵母的为37S。

⑶、核糖体亚单位的装配

新合成的45SrRNA很快与蛋白质形成RNP复合体（80S的RNP），45SrRNA甲基化以后经RNA酶裂解为2个分子，18SrRNA和32SrRNA，后者再裂解为28SrRNA的5.8SrRNA。成熟的rRNA仅为45SrRNA的一半，丢失的大部分是非甲基化和GC含量较高的区域。    5S rRNA合成后被转运至核仁区参与大亚基的装配。

试述染色体结构与基因转录的关系：

（一）疏松染色质结构的形成

1、DNA局部结构的改变与核小体位相变化；    ATP依赖的SWI/SNF染色质改构复合物的作用；    拓扑异构酶能调节DNA双螺旋的局部构象和高级结构变化；    B型DNA变成Z型DNA会导致核心组蛋白八聚体与DNA的亲和力降低；    转录因子对增强子和启动子的影响。

2、组蛋白的修饰

     核小体组蛋白八聚体的N端都暴露在核小体外，某些特殊氨基酸的残基可能发生乙酰基化、甲基化、磷酸化或核糖基化等修饰，结果一是改变染色质结构，直接影响基因转录；二是核小体表面发生改变，易于调控蛋白与染色质接触。

（1）核心组蛋白的赖氨酸残基乙酰化

       乙酰化后组蛋白赖氨酸侧链不再带有正电荷，失去了与DNA的结合能力，使相邻核小体的结合受阻，同时影响泛素与组蛋白H2A的结合，导致蛋白质选择性降解。组蛋白H3和H4是修饰的主要位点。

      组蛋白去乙酰化伴随着对转录的抑制。

（2）组蛋白H1的磷酸化

      组蛋白H1丝氨酸残基的磷酸化发生在有丝分裂前期，H1的磷酸化导致DNA 的亲和力下降，染色质松解，影响染色质活性。

3、HMG结构域蛋白的影响

      HMG1和HMG2有A、B、C三个结构域，A、B结构域与DNA 特异亲和，细胞中有一类蛋白具有这种结构域的特点，称为HMG结构域，相应的DNA序列称为“HMG box”。

4、SMC蛋白对染色质结构的影响

      在有丝分裂前期对染色体配对和集缩起重要作用。

（二）染色质的区间性

1、基因座控制区

      基因座控制区(LCR)是染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。

2、隔离子

     基因表达有位置效应，变换位置会导致活性改变。能防止处于阻抑状态与活化状态的染色质结构域之间的结构特点向两侧扩展的染色质DNA序列，称隔离子。

（三）染色质模板的转录

真核细胞基因转录的模板是染色质而不是裸露的DNA，基因转录时仍可相对保留核小体结构。RNA聚合酶差不多有两个核小体那么大，但只和大约50 bp的DNA结合。RNA聚合酶被认为是用核小体犁来克服转录障碍的，SWI/SNF被认为是一种有效的核小体犁。