（6）倒置显微镜技术

由于物镜、聚光镜和光源的位置颠倒过来而得名，它的物镜和聚光镜之间的工作距离很长，能直接对培养皿中的培养细胞进行观察，还可与电视录像、相差物镜、电影摄影等装置相连。

光学显微镜和电子显微镜的区别及应用：

对电镜观察的生物样品制备技术的特殊要求：（1）样品要薄；（2）更好地保持样品的精细结构；（3）样品具有一定的反差。

扫描隧道显微镜（STM）

由1986年的诺贝尔物理学奖获得者宾尼和罗雷1981年发明的。能达到横向0.1nm，纵向高于0.01nm原子级分辨率，能直接观察到物质表面的原子结构，描绘三维原子结构图，并能对表面非常局部的区域产生。

STM的原理是利用量子隧道效应和扫描，它用一个极细的针尖（头部有个单原子）去接近样品表面，当针尖和表面靠近小于1nm时，针尖头部原子和样品表面原子的电子云发生重叠。若在针尖和样品间加上一个偏压，电子会通过针尖和样品间构成势垒而形成隧道电流。通过控制针尖与样品间距的恒定并使针尖沿表面进行精确的三维移动，就可以把表面的信息记录下来。

细胞分析：离心方法：

利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示。沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离心场作用下的沉降速率。

细胞化学方法内容：

原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。

（1）福尔根反应可特异显示DNA的存在部位；

（2）PAS反应可确定多糖的存在；

（3）四氧化锇可证明脂肪滴的存在；

（4）苏丹III和苏丹黑常用于脂肪的鉴定；

（5）米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。

检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来。

单克隆抗体技术的制备过程。

（1）1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生的抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功地建立了单克隆抗体技术。

（2）动物受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞承担的；肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。

（3）Milstein和Kohler为了制备纯一的单克隆抗体，把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊免疫过的小鼠细胞（B淋巴细胞）在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。

（4）融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌抗绵羊红细胞的抗体，另一方面可以在体外培养条件下或移植到体内无限增值，从而分泌大量单克隆抗体。

细胞工程内容：

细胞工程是应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术的领域为细胞工程。细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。

第四章．细胞膜与细胞表面

一、知识点：

1、膜骨架蛋白包括血影蛋白，肌动蛋白，锚蛋白，带4.1蛋白。

2、膜骨架蛋白网络也细胞膜之间的连接主要通过锚蛋白。

3、天疱疮患者：

4、细胞与细胞连接（黏着带、桥粒），细胞与基质连接（黏着斑、半桥粒）

5、在Ehlers-Danlos综合症中，由于缺乏一种切除前肽的酶，则胶原不能正常装配为高度有序的纤维。

二、名词解释：

细胞膜：细胞膜又称质膜，是指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜。

生物膜：细胞内的膜系统与细胞膜统称为生物膜。

脂筏模型：在生物膜上胆固醇富集而形成有序脂向，如同“脂筏”一样载着各种蛋白，脂筏最初可能在内质网上形成，转运到细胞膜上后，有些脂筏可在不同程度上与膜下细胞骨架蛋白交联。

内膜系统：细胞的内膜系统是在结构、功能乃至发生上相关的，由膜围绕的细胞器或细胞结构。主要包括内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡等。

脂质体：是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。

去垢剂：去垢剂是一端亲水一端疏水的两性小分子，是用于分离与研究膜蛋白的常用试剂。包括离子型与非离子型。

成斑现象：在某些细胞中，当荧光抗体标记时间继续延长，以均匀分布在细胞表面的标记荧光会重新排布，聚集在细胞表面的某些部位，即所谓成斑现象。

成帽现象：在某些细胞中，当荧光抗体标记时间继续延长，以均匀分布在细胞表面的标记荧光会重新排布，聚集在细胞的一端，即所谓成帽现象。

膜骨架：膜骨架指质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构，它参与维持质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。

血影：红细胞经低渗处理，细胞破裂释放出内容物，留下一个保持原形的空壳，称为血影。

紧密连接：是封闭连接的主要形式，可以阻止可溶性物质从上皮细胞层一侧扩散到另一侧，具有封闭、隔离和一定的支持功能。一般存在于上皮细胞之间。

锚定连接：

桥粒：存在于承受强拉力的组织中。相邻细胞中的中间纤维通过细胞质斑和钙粘素构成了穿胞细胞骨架网络，形成纽扣状结构。

半桥粒：

粘合带：呈带状环绕细胞，一般位于上皮细胞顶侧面的紧密连接下方。间隙中的粘合分子为E-钙粘素。相邻细胞中的肌动蛋白丝束通过钙粘蛋白和附着蛋白编织成了一个广泛的网络，把相邻细胞联合在一起。

粘合斑：位于细胞与细胞外基质间，通过整合素把细胞中的肌动蛋白束和基质连接起来；连接处的质膜呈盘状，称为粘合斑。

连接子：间隙连接的间隙与两层质膜中有大量蛋白质颗粒，是构成间隙连接的基本单位，称连接子，

胞间连丝：是植物细胞特有的通讯连接，是由穿过细胞壁的质膜围成的细胞质通道组成，内填充有一圈细胞质溶质。一些小分子可通过细胞质溶质环在相邻细胞间传递。

细胞外被：

细胞外基质：是由大分子构成的错综复杂的网络，为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。

糖胺聚糖：

透明质酸：

蛋白聚糖：

三、简答论述：

请简要说明细胞膜结构模型的发展历程

双层脂分子 ——〉“蛋白质-脂质-蛋白质”三明治模型 ——〉单位膜模型

    ——〉流动镶嵌模型 ——〉脂筏模型

请简要说明生物膜的结构

（1）具有极性头部和非极性尾部的磷脂分子在水相中具有自发形成封闭的膜系统的性质，以疏水性非极性尾部相对，极性头部朝向水向的磷脂双分子层是组成生物膜的基本结构成分，尚未发现在生物膜结构中起组织作用的蛋白。

（2）蛋白分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，蛋白的类型，蛋白分布的不对称性及其与脂分子的协同作用赋予生物膜具有各自的特性与功能。

（3）生物膜可看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液。然而，膜蛋白与膜脂之间，膜蛋白与膜蛋白之间及其与膜两侧其他生物大分子的复杂的相互作用，在不同程度上限制了膜蛋白和膜脂的流动性。

简述膜流动性的影响因素

（1）胆固醇：胆固醇的含量增加会降低膜的流动性；

（2）脂肪酸链的饱和度：脂肪酸链所含双键越多越不饱和，使膜流动性增加；

（3）脂肪酸链的链长：长链脂肪酸相变温度高，膜流动性降低；

（4）卵磷脂/鞘磷脂：卵磷脂/鞘磷脂比例高则膜流动性增加，是因为鞘磷脂粘度高于卵磷脂；

（5）膜蛋白和膜脂的结合方式、温度、酸碱度、离子强度等都可以影响膜脂的流动性。

请问组成生物膜的磷脂分子的主要特征是什么？

膜蛋白的种类（膜蛋白由哪些物质组成）：

膜蛋白是膜功能的主要体现者。根据膜蛋白与脂分子的结合方式，可分为膜内在蛋白、膜外在蛋白（和膜锚定蛋白。

1.膜内在蛋白

（1）膜内在蛋白可能全为跨膜蛋白，为两性分子，疏水部分位于脂双层内部，亲水部分位于脂双层外部。

（2）由于存在疏水结构域，整合蛋白与膜的结合非常紧密，只有用去垢剂才能从膜上洗涤下来，如离子型去垢剂SDS、非离子型去垢剂Triton X-100。

（3）膜整合蛋白的跨膜结构域可以是1至多个疏水的α螺旋，形成亲水通道的整合蛋白由多个两性α螺旋组成或由两性β折叠组成亲水通道。

2.膜外周蛋白

膜外周蛋白靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子的亲水部分结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，有时很难区分整合蛋白和外周蛋白，主要是因为一个蛋白质可以由多个亚基构成，有的亚基为跨膜蛋白，有的则结合在膜的外部。

3.膜锚定蛋白

糖磷脂酰肌醇锚定蛋白位于细胞膜的外小叶，用磷脂酶C（能识别含肌醇的磷脂）处理细胞，能释放出结合的蛋白。许多细胞表面的受体、酶、细胞粘附分子和引起羊瘙痒病的PrPC都是这类蛋白。

膜内在蛋白与膜脂结合的方式？

简要说明膜的流动性（从膜脂流动和膜蛋白流动两个方面）

膜蛋白分子主要有侧向扩散和旋转扩散两种运动方式，可用光脱色恢复技术和细胞融合技术检测侧向扩散。旋转扩散指膜蛋白围绕与膜平面垂直的轴进行旋转运动，膜蛋白的侧向运动受细胞骨架的限制，破坏微丝的药物如细胞松弛素B能促进膜蛋白的侧向运动。

膜脂分子的运动：

（1）侧向扩散：同一平面上相邻的脂分子交换位置；

（2）旋转运动：膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转；

（3）摆动运动：膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行左右摆动；

（4）伸缩震荡：脂肪酸链沿着与纵轴进行伸缩震荡运动；

（5）翻转运动：膜脂分子从脂双层的一层翻转到另一层；

（6）旋转异构：脂肪酸链围绕C-C键旋转，导致异构化运动。

怎样说明膜的不对称性?

膜脂的不对称性：

脂分子在脂双层中呈不均匀分布，质膜的内外两侧分布的磷脂的含量比例也不同。磷脂酰胆碱和鞘磷脂主要分布在外小页，而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸主要分布在质膜内小叶。用磷脂酶处理完整的人类红细胞，80%的磷脂酰胆碱降解，而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸分别只有20%和10%的被降解。

膜蛋白的不对称性：

膜蛋白的不对称性是指每种膜蛋白分子在细胞膜上都具有明确的方向性和分布的区域性，各种膜蛋白在膜上都有特定的分布区域。某些膜蛋白只有在特定膜脂存在时才能发挥其功能，如蛋白激酶C结合于膜的内侧，需要磷脂酰丝氨酸的存在下才能发挥作用；线粒体内膜的细胞色素氧化酶，需要心磷脂存在才具活性。

3.复合糖的不对称性

无论在任何情况下，糖脂和糖蛋白只分布于细胞膜的外表面，这些成分可能是细胞表面受体，并且与细胞的抗原性有关。

细胞膜的功能有哪些？

（1）为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；

（2）选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排出；

（3）提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息的跨膜传递；

（4）为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；

（5）介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接；

（6）参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

细胞外被的作用有：

（1）保护作用：细胞外被具有一定的保护作用，去掉细胞外被，并不会直接损伤质膜。

（2）细胞识别：细胞识别与构成细胞外被的寡糖链密切相关。寡糖链由质膜糖蛋白和糖脂伸出，每种细胞寡糖链的单糖残基具有一定的排列顺序，编成了细胞表面的密码，它是细胞的“指纹”，为细胞的识别形成了分子基础；同时细胞表面尚有寡糖的专一受体，对具有一定序列的寡糖链具有识别作用。细胞识别实质上是分子识别。

（3）决定血型：血型实质上是不同的红细胞表面抗原，人有20几种血型，最基本的血型是ABO血型。红细胞质膜上的糖鞘脂是ABO血型系统的血型抗原，血型免疫活性特异性的分子基础是糖链的糖基组成。A、B、O三种血型抗原的糖链结构基本相同，只是糖链末端的糖基有所不同。

什么是紧密连接？

又称封闭小带，存在于脊椎动物的上皮细胞间，相邻细胞之间的质膜紧密结合，没有缝隙。上皮细胞层对小分子的透性与嵴线的数量有关，有些紧密连接甚至连水分子都不能透过。

紧密连接的主要作用是封闭相邻细胞间的接缝，防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内，从而保证了机体内环境的相对稳定；消化道上皮、膀胱上皮、脑毛细血管内皮以及睾丸支持细胞之间都存在紧密连接

关于锚定连接

1.粘合带与粘合斑

粘合带呈带状环绕细胞，一般位于上皮细胞顶侧面的紧密连接下方。在粘合带处相邻细胞的间隙约15-20nm，间隙中的粘合分子为E-钙粘素。粘合带处的质膜下方有与质膜平行排列的肌动蛋白束，钙粘蛋白通过附着蛋白与肌动蛋白束相结合。相邻细胞中的肌动蛋白丝束通过钙粘蛋白和附着蛋白编织成了一个广泛的网络，把相邻细胞联合在一起。

粘合斑位于细胞与细胞外基质间，通过整合素把细胞中的肌动蛋白束和基质连接起来；连接处的质膜呈盘状，称为粘合斑。

2.桥粒与半桥粒

桥粒存在于承受强拉力的组织中，如皮肤、口腔、食管等处的复层鳞状上皮细胞之间和心肌中。相邻细胞间形成纽扣状结构，细胞膜之间的间隙约30nm，质膜下方有细胞质附着蛋白质，如片珠蛋白、桥粒斑蛋白等。斑上有中间纤维相连。

半桥粒在结构上类似桥粒，位于上皮细胞基面与基膜之间，它桥粒的不同之处在于：

（1）只在质膜内侧形成桥粒斑结构，其另一侧为基膜；

（2）穿膜连接蛋白为整合素而不是钙粘素，整合素是细胞外基质的受体蛋白；

（3）细胞内的附着蛋白为角蛋白。

简要说明间隙连接及其调控机制

间隙连接存在于大多数动物组织。连接子是构成间隙连接的基本单位，由6个相同或相似的跨膜蛋白亚单位环绕而成，直径8nm，中心形成一个直径约1.5nm的孔道。=细胞内的小分子，如无机盐离子、糖、氨基酸、核苷酸和维生素等有可能通过间隙连接的孔隙。

间隙连接的通透性是可调节的，在实验条件下，降低细胞pH值或升高Ca2+浓度均可降低间隙连接的通透性。当细胞破损时，大量Ca2+进入，导致间隙连接关闭，以免正常细胞受到伤害。

间隙连接的主要作用有：

（1）参与细胞分化：胚胎发育的早期，细胞间通过间隙连接相互协调发育和分化。小分子物质即可在一定细胞群范围内，以分泌源为中心，建立起递变的扩散浓度梯度，以不同的分子浓度为处于梯度范围内的细胞提供位置信息，从而诱导细胞按其在胚胎中所处的局部位置向着一定方向分化。

（2）协调代谢：在体外培养条件下，把不能利用外源次黄嘌呤合成核酸的突变型成纤维细胞和野生型成纤维细胞共同培养，则两种细胞都能吸收次黄嘌呤合成核酸；如果破坏细胞间的间隙连接，则突变型细胞不能吸收次黄嘌呤合成核酸。

（3）构成电紧张突触：平滑肌、心肌、神经末梢间均存在的这种间隙连接，称为电紧张突触（electrotonic synapses）。电紧张突触无须依赖神经递质或信息物质即可将一些细胞的电兴奋活动传递到相邻的细胞。

化学突触

化学突触时存在于可兴奋细胞间的一种连接方式，其作用是通过释放神经递质来传导兴奋，由突触前膜、突触后膜和突触间隙三部分组成。

突触前神经元的突起末梢膨大呈球形，称突触小体，突触小体贴附在突触后神经元的胞体或突起的表面形成突触。突触小体的膜称突触前膜，与突触前膜相对的胞体膜或突起的膜称突触后膜，两膜之间称为突触间隙。突触小体内有许多囊泡，称突触小泡，内含神经递质。当神经冲动传到突触前膜，突触小泡释放神经递质，为突触后膜的受体接受（配体门通道），引起突触后膜离子通透性改变，膜去极化或超极化。

简要说明细胞表面的黏着因子

细胞粘附分子（CAM）是参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间相互作用的分子，细胞粘附分子可大致分为钙粘素、选择素、免疫球蛋白超家族、整合素及透明质酸粘素五类。

细胞粘附分子都是跨膜糖蛋白，分子结构由三部分组成，即胞外区（肽链的N端部分，带有糖链，负责与配体的识别）、跨膜区（多为一次跨膜）和胞质区（肽链的C端部分，一般较小，或与质膜下的骨架成分直接相连，或与胞内的化学信号分子相连，以活化信号转导途径）。

多数细胞粘附分子的作用依赖于二价阳离子，如Ca2+，Mg2+。细胞粘附分子的作用机制有两相邻细胞表面的同种CAM分子间的相互识别与结合（亲同性粘附）、两相邻细胞表面的不同种CAM分子间的相互识别与结合（亲异性粘附）、两相邻细胞表面的相同CAM分子借细胞外的连接分子相互识别三种方式。