3. 大肠杆菌色氨酸操纵子转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制的，当色氨酸供应不足时，阻遏物失了所结合的色氨酸，从操纵区上解离下来，trp操纵子的转录就此开始。这个系统是典型的负控诱导系统。
4. 大肠杆菌麦芽糖操纵子的调控是典型的正控阻遏系统，这里麦芽糖是诱导物，激活蛋白只有与麦芽糖结合时才能与DNA的特殊结合位点结合，促使RNA聚合酶开始转录。
5．分解代谢物阻遏中，葡萄糖进入细胞后，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合，操纵子就不表达。
6．大肠杆菌的rRNA的操纵子上有两个启动子P1和P2，细菌在对数生长期时，P1起始的转录产物比P2大3—5倍，所以n是强启动子。但是当细菌处于氨基酸饥饿的紧急状态时，细胞内ppGpp浓度增加，这时P1的作用被抑制，由P2启动少量的rRNA的合成，以维持生命的最低需要。
7．σ70基因作为σ操纵子的一部分而转录多基因的mRNA，但σ70基因本身还有一个热激应答启动子，σ70基因在热激应答反应中大量表达，这一情况与细菌的热激应答反应需要σ70密切相关。
8．当MCP未与引诱物结合时，该复合物刺激CheA自身磷酸化，进而再使CheY和CheB两个细胞质蛋白也磷酸化，CheY—P与鞭毛传动器结合，启动鞭毛／顷时针旋转，细菌作翻筋斗运动。如果引诱物结合到MCP上，则CheA的自身磷酸化被抑制，CheY不能与鞭毛传动器结合，此时鞭毛逆时针旋转，细菌则进行直线运动。
9．当溶源菌受到紫外线等因素作用时，由于DNA上造成损伤，RecA蛋白具有切割阻遏蛋白的活性，使CI蛋白被切割，亚基被破坏，CI蛋白从DNA上脱落，于是RNA聚合酶便有机会与cro基因的启动子结合，表达Cro蛋白，使转录向裂解方向进行，即Cro蛋白阻止cI基因的表达，起负调控作用。
10．同一种微生物细胞中不同蛋白质的mRNA的稳定性相差很大，mRNA的稳定性是影响翻译效率的一个很重要的因素，基因的表达量与mRNA的半衰期成反比例关系。
11．大肠杆菌质粒ColEI的复制是受反义RNA调节的例证之一，因为RNAI能够与质粒DNA复制时的引物RNA结合，所以DNA聚合酶不能与引物RNA结合，致使质粒复制受阻，这样，RNAⅠ 通过调节RNA引物数目来对DNA的复制实行控制。
12.分泌的启动和抑制调控与SRP有关，由于$RP暂时中止这些分泌蛋白的转录，能确保这些蛋白质未达到细胞膜或内膜之前不能完成转录，这样，在信号肽和SBP的共同作用下，使得这些分泌蛋白能及时完成转运和分泌。
  问答题
    I．简述负控诱导和正控诱导两种操纵子转录调控的差异。
    2．为什么说乳糖操纵子的功能实际上是在正、负两个相互独立的调控体系作用下实现的?
    3．在负控系统中，如果操纵区缺失，将会发生什么情况，在正控系统中又将怎样呢?
    4．为什么弱化作用只影响合成代谢，而阻遏作用既影响合成代谢途径也能影响分解代谢途径’
    5．原核生物只有一种RNA聚合酶，通过什么途径识别不同的启动子并进行不同基因的转录?举例说明。
    6，解释为什么无义密码的功能在蛋白质的合成中为终止位点，而在mRNA的合成中就不能作为终止位点
三、习题解答
    填空题
    1。二聚体    2．螺旋—转角—螺旋结构  锌指结构  亮氨酸拉扣结构    3。负转录调控  正转录调控    4。葡萄糖效应  葡萄糖    5．cAMP  cAMP    6．鸟苷四磷酸(ppGpp)  鸟苷五磷酸(pppGpp)    7  热激应答反应    e．磷酸化  磷酸化    9．裂解  溶源    10．核糖体结合； 序列{RBS)    11．长  表达量    12．表达量    ]3  反义RNA    14．蛋白质阻遏    15．核糖体蛋白质  rRNA    16  信号肽醇
 选择题
 1．A    2，D    3．A    4．D    5．C    6．C    7．  B    8．  A    9  D    10  B
 是非题
1．  十   2.  一    3.  一    4。  一    5．  十    6．  十  7．  一    8.  十    9．  十    10    一    11．  十    12．  一
问答题
1．两者的主要差别在于：①调节基因的产物在负控中是阻遏蛋白，在正控中是激活蛋白。②阻遇蛋白的结合位点是操纵区，激活蛋白的结合位点是激活蛋白结合位点。
2．虽然乳糖操纵于是典型的负控诱导系统．在环境中如果有乳糖或类似物，就可诱导转录，但是如果没有CAP-cAMP  调控因子与操纵子相应部位的结合，乳糖操纵子即使在有诱导物的存在下，也不能转录，所以它是受双重控制的。
3．在负控诱导系统中，如果操纵区缺失，将发生组成型的合成利用乳糖的酶。在负控阻遏系统中，则实际上是形成了抗阻遏突变，无论阻遏物是否存在，细胞均能不断合成终产物(如色氨酸在正控诱导系统中，激活蛋白的作用部位不是操纵区，故不受影响。
4．因为弱化作用是受氨酰—tRNA的控制，是氨基酸合成代谢途径中的一种调控作用；而阻遏作用中，操纵子是受阻遏蛋白的控制，是调节基因的产物，在分解代谢(乳糖的分解)和合成代谢(色氨酸的合成)中均存在。
5．原核生物的RNA聚合酶通过与不同的σO因子结合组成全酶后才进行工作的。不同的口因子协助RNA聚合酶识别不同的启动子，并启动转录。例如：大肠杆菌在正常的条件下，σ70．TM因子指导RNA聚合酶的活成，如果大肠杆菌生长在较高的温度下，便产生σ32，由σ32参人构成的RNA聚合酶全酶能够识别热激应答基因的启动子，刺激产生大量的热休克蛋白质，保证细胞不受高温的伤害。此外，枯草芽孢杆菌中通过利用大量不同的σ因子识别不同的启动子，从而控制芽孢的形成过程也是研究得比较详细的例子。    •
6．这里涉及两个基本概念：转录和翻译。蛋白质的合成(即翻译)是以mRNA为模板，通过氨酰—tRNA将其遗传密码翻译成为多肽顺序的复杂过程，当核糖体到达3种无义密码子(UAA、UAG和UGA)中的任何一个时，由于没有任何氨酰—tRNA与这些终子密码结合，所以不能将这些密码翻译成氨基酸，肽链的合成便被终止。在mRNA的合成(转录)中，是以DNA为模板，通过RNA聚合酶催化合成RNA的过程。即以一条DNA链为模板，按照碱基互补的原则进行转录，不涉及终止密码。转录的终止是通过终止子(terminator)而实现的。
第十章 微生物与基因工程
 
一、术语或名词
1、基因工程(gene engineering)  或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导人宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。
2．基因文库(genomiclibrary)  是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每二个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。一般适用于原核微生物基因的分离。
3。cDNA文库(cDNA library)  是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。一般适用于真核微生物基因的分离。
4．多克隆位点(multiplecloningsite)  是克隆载体上一个带有不同限制酶单一识别位点的短66DNA片段，外源基因可随意插人任何一个切点。多克隆位点常位丰一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。
5．穿梭质粒载体(shuttleplasmid vector)  是一类同时含有两种细胞的复制起点(特别是同时含有原核生物与真核生物的复制起点)，能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。
6．附加体质粒(episomal plasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)。此外还有来自酵母21xm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因(尿嘧啶核苷酸合成酶基因)，这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，重组质粒导人酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
7．复制质粒(replicating plasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)和四环素抗性基因(Tet’)。还有来自酵母染色体的自主复制序列(ARS)，以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRPl基因(色氨酸合成酶基因1)，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
8．整合质粒(integratingplasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)、四环素抗性基因(Tet，)。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导人酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
9．人工染色体(artificialchromosome)  是利用已知染色体结构和功能的必须组分，人工构建的小于天然染色体但能在宿主细胞中像正常染色体一样复制、分离和传递的DNA结构。酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)，是由酵母染色体端粒、着丝粒、自主复制序列以及选择标记基因(如TRPl和URA3等)构成的线状DNA。是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。细菌人工染色体(bacteriaartificialchromosome，BAC)，是以F因子为基础的载体，容纳的插入片段可达300kb。由于是低拷贝质粒，克隆DNA较稳定，没有酵母人工染色体的嵌合现象。易通过电击转移到大肠杆菌中。
10．限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)  或简称为限制性酶(restrition enzyme)，是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。
二、习  题
填空题
1．基因工程的基本过程是        ， 阳性重组子的筛选基因的测序和鉴定+基因的控制表达。目的基因的获得可以通过构建基因文库或cDNA文库来筛选目的基因片段，        文库一般适用于原核微生物基因筛选，           文库一般适用于真核生物基因筛选。
2．原核生物大肠杆菌的克隆载体中，能够容纳最大的外源DNA片段的载体是         ，可容纳DNA片段大小为       ；酵母质粒载体都是利用           质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有        、       和          3种。目前能容纳最大外源DNA片段的载体是          。
3．基因工程操作需要用一些基本的工具酶，它们大多数来源于各种微生物。如基因与载体的切割        和连接要用各种          酶和        酶，DNA的体外合成、测序要用           酶、          酶；RNA反转录要用         酶等。
4．克隆载体宿主是外源基因能够在细胞中大量扩增和表达的基本要素。宿主细胞非常重要的特性是不具有         ，不能降解导人的未经修饰的外源DNA；不具有          ，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。目前最常用的原核克隆宿主是             和          真核克隆宿主是            。
5．外源DNA导人原核细胞可以采用以下3种方法：         方法，即重组质粒载体导人感受态细胞；         方法，即重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导人感受态细胞；        方法，即外源DNA被包装成A噬菌体颗粒导人宿主细胞。
6．酵母细胞、哺乳动物细胞和植物细胞外源DNA的导入都可以采用    方法，此外酵母细胞还常采用          方法，哺乳动物细胞和植物细胞还常采用           方法。
7．限制性酶的命名是根据分离出此酶的         而定的，即取         的第一个字母和          的头两个字母组成3个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。
8．重组体表型特征的鉴定常用的方法有          、           、          和          。
选择题 (4个答案选1)
1．大肠杆菌的克隆载体中，常规使用的质粒载体可以克隆的最大DNA片段是(    )。A300～400bp    B25 kb    C15 kb  D40kb
2．为了在酵母菌中表达外源基因的稳定性，通常使用的载体是(    )。A2 txm质粒    B附加体质粒    C复制质粒    D整合质粒
3．下面的哪个选项不适合作为基因工程克隆载体(    )。A转座子    B质粒    C柯斯质粒    D噬菌体
4．人工染色体必须具有的元件是(    )。A染色体端粒    B着丝粒    C自主复制序列    D以上三项全部
5．真核生物目的基因的获得不能采用的方式是(    )。A DNA文库筛选    BcDNA文库筛选   CPCR体外扩增    DDNA的合成
6．外源DNA导人原核细胞可以采用转染法，即(  )。A重组质粒载体导人感受态细胞 B重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导人感受态细胞
C外源DNA被包装成入噬菌体颗粒导人宿主细胞    D电转化法  
7．利用α—互补作用进行的重组体细胞的筛选中，含有外源DNA片段的重组体细胞在含有X—gal—IPTG平板中生长的菌落颜色是(    )。    A蓝色    B白色    C红色    D黄色。
8．外源DNA导人宿主细胞的方法中，不是依据转化方式原理而进行的方法是(    )。
   A重组质粒载体+感受态细胞    B重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒+感受态细胞
  C外源DNA被包装成A噬菌体颗粒+宿主细胞  D酵母质粒载体+酵母细胞的原生质体
是非题
1．所有生物的目的基因的获得都可以从该种生物的DNA文库中直接进行筛选。
2．所有基因工程中的工具酶都是微生物来源的。
3．大肠杆菌是最常用的各种生物基因克隆载体构建的宿主菌。
4．任何一种微生物的野生型菌株细胞都可以作为克隆宿主。
5．所有微生物产生的限制性内切酶切割DNA后，都产生黏性末端。
6，把重组DNA载体导人宿主细胞中，电转化法可以适合各类生物细胞。
7，非电击条件下，把重组DNA载体导人大肠杆菌细胞中所依据的原理是转化和转导。
8．如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，则具有抗性的细胞肯定是重组
  体细胞。
问答题
1．从基因工程的基本过程和基因工程的应用及展望两个方面来说明微生物与基因工程的关系。
2．为什么DNA文库可以直接用于原核生物的目的基因筛选，而不能用于真核生物的目的基因筛
  选?真核生物的目的基因筛选常用的方法是什么?
三、习题解答
填空题
1．目的基因的获得  重组载体的构建  重组载体导人宿主细胞  基因  cDNA    2．柯斯质粒载
体  45kb  21xm  附加体质粒  复制质粒  整合质粒  人工染色体    3．限制性内切  连接
Taq  pfuDNA高保真聚合  反转录    4．限制修饰系统  DNA重组系统  大肠杆菌  酿酒酵母
5．转化法  转染法  感染法    6．电穿孔法  原生质体转化法  微量注射法    7．微生物学名
  微生物属名  种名    8．抗生素平板法  插入失活法  插入表达法  口—半乳糖苷酶显色法
选择题
1．  C    2．  D    3．  A    4．  D    5．  A    6．  B    7．  B    8．  C
是非题
1，  一    2．  一    3．  +    4．  一    5．  一    6．  +    7．  +    8．  一
问答题
1．基因工程的基本过程：目的基因的获得+重组载体的构建斗重组载体导人宿主细胞+阳性重组子的筛选+基因的测序和鉴定斗基因的控制表达。每一个环节都离不开微生物的参与。微生物世界的多样性为人类的活动提供了取之不尽、用之不竭的基因来源；基因工程的克隆载体通常由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成；基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的；基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主是原核生物的大  肠杆菌及真核生物的酿酒酵母。植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。基因工程的应用表现在基因工程药物、基因治疗、改造传统工业发酵菌种、动植物特性的基因工程改良及环境保护中各个方面，并已经取得了丰硕的成果。同时基因工程也推动了微生物学的发展，特别是对于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。
2．由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多(通常大约仅有15％左右基因被表达)。由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。
真核生物的基因含有内含子，在原核生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。常用方法：cDNA文库筛选，mRNA反转录后PCR体外扩增，DNA合成等。
第十一章 微生物的生态
一、术语或名词
1. 生态系统(ecosystem) 在一定的空间内生物的成分和非生物的成分通过物质循环和能量的流动互相作用、互相依存而构成的一个生态学功能单位。
2．生物地球化学循环(biogeochemicalcycles)  生物圈中的各种化学元素，经生物化学作用在生物圈中的转化和运动。
3．固氮作用(nitrogenfixation)  大气中氮被转化成氨(铵)的生化过程。
4．氨化作用(ammonification)  有机氮化合物转化成氨(铵)的生化过程。
5．硝化作用(nitrification)  好氧条件下在无机化能硝化细菌作用下氨被氧化成硝酸盐的过程。
6．嗜热微生物(thermophilicmicroorganisms)  最适生长温度在45℃以上，中温条件下能生长(或不能生长)的微生物。
7．嗜冷微生物(psychrophilicmicroorganisms)  最适生长温度在20~C以下，0~C或低于0℃可以生长，20℃以上生长或不生长的微生物。
8．嗜酸微生物(acidophilicmicroorganisms)  生长最适pH在3—4以下，中性条件不能生长的微生物。
9．嗜碱微生物(alkaliphilicmicroorganisms)  生长最适pH在9以上，中性条件不能生长的微生物。
10．嗜盐微生物(halophilicmicroorganisms)  生长最适盐浓度在0．2～0．25 mol／L以上的微生物。
11．嗜压微生物(barophilicmicroorganisms)  需要高压才能良好生长的微生物。
12．根际微生物(rhizospheremicroorganisms)  邻接植物根土壤区域中生长的微生物。
13．菌根(mycorrhiza)  一些真菌和植物根以互惠关系建立起来的共生体。
14．共生固氮(symbioticnitrogenfixation)  根瘤菌和植物根通过它们相互作用形成成熟根瘤固定大气中氮的复杂生理生化过程。
15．生物气溶胶(bioaerosols)  悬浮在大气中的气溶胶、微生物、微生物副产物和花粉的集合体。
16．生物降解(biodegradation)  微生物(也包括其他生物)对有机化合物(特别是环境污染物)的分解作用。
17．降解性质粒(catabolicplasmids)  编码难降解有机化合物降解酶的质粒。
18．污水处理(wastewatertreatment)  利用微生物在特定生物反应器中降解有机污染物净化污水的生化过程。
19．活性污泥法(activatedsludgeprocess)  利用由微生物与污水(废)水中的有机、无机固体物混凝交织、形成的活性污泥处理污水的过程。
20．生物膜法(biofiltration process)  在生物滤床中利用附着在滤料表面的生物膜净化污水的过程。
21．堆肥化处理(compostingtreatment)  有控制地在反应器中利用微生物转化有机废弃物(生活垃圾及其他有机固体废弃物)向稳定的腐殖质转化的生物化学过程。
22．生物修复(生物整治)(bioremediation)  用生物学介导的方法，主要利用微生物、植物从特殊环境中(尤其是原位)除去或降解污染物从而消除污染、修复污染环境的工程化处理过程。 
二、习题
填空题
  1．从         ，            ，         ，           生境中可以分离到嗜热微生物；从         ，          ，生境中可以分离到嗜冷微生物；从           、           生境中可分离到嗜酸微生物；从         ，            ，生境中可分离到嗜碱微生物；从           、             和           生境中可分离到嗜盐微生物。