限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。
具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。
5. 2 DNA操作技术
5. 2. 1核酸的凝胶电泳
自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
基本原理
一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。
生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。
5. 2. 2 核酸的分子杂交
将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。
经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。由于该方法是E. M. Southern首先设计出来的，所以又叫做Southern blotting。
在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。
5. 2. 3 细菌转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。
42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。
5. 2. 4 核苷酸序列分析
1）Sanger双脱氧链终止法
Sanger等人于1977年发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，该法有时也称为引物合成法或酶催引物合成法。
它利用了DNA聚合酶的两种酶催反应特性：
能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链；
能够利用2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物，将其掺入到寡核苷酸链的3'-末端，从而终止DNA链的生长。
2）Maxam-Gilbert化学修饰法：
用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，特异性切割碱基，产生一组各种不同长度的DNA片段的混合物，经电泳分离和放射自显影之后，根据X光片上所显现的相应谱带，判定DNA序列。
在碱性的条件下，肼（hydrazine，又叫联氨，NH2•NH2）能够从C4和/或C6原子位置作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基，环化形成新的5原子环。有六氢吡啶（piperidine）存在时，通过β-消除反应，释放2个磷酸分子并在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。
如果加入1mol/L浓度的盐，那么联氨同胸腺嘧啶的反应速率便会明显下降，发生胞嘧啶特异的化学切割反应。
硫酸二甲酯是一种碱性的化学试剂，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。
在中性pH条件下，鸟嘌呤和腺嘌呤残基上的甲基化足以导致配糖键发生水解，DNA链断裂。
加入六氢吡啶后，就只在G而不是A残基上发生DNA链的断裂。
在酸性环境中，因嘌呤碱基的质子化作用（protonation）导致脱嘌呤效应，会使配糖键发生水解，再经过六氢吡啶催化的β-消除作用移去磷酸分子，于是就会在这个位点上发生DNA链的断裂。这一反应是嘌呤碱基特异的。
3）DNA序列分析的自动化
包括两个方面：即“分析反应”的自动化和“读片过程”的自动化，后者是问题的关键。
现在大多采用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光，从而取代同位素标记。
在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道小孔，在凝胶板的上面装荧光信号接收器。当DNA条带在电场的作用下经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA受激发产生荧光。荧光感受器收到荧光信号后，转换数据，判定核酸序列。
4）DNA杂交测序法（SBH，sequencing by hybridization）。
它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。
DNA杂交测序法，没有繁琐的凝胶电泳，不需要核酸酶，不需要进行复杂的化学反应，十分适合于大规模DNA序列分析。
1.DNA杂交测序包括两个步骤：
将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交。
与能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。
如果将5’-AGCCTAGCTGAA-3’的12-mer靶DNA，与完全随机的8-mer寡核苷酸探针杂交，在总数为48=65 536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链体。根据这5种完全杂交的8-mer探针之间的重叠关系，便可推算出靶DNA分子的核苷酸序列。
图5-14是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。
靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降。
与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。
与第9段8-mer寡核苷酸能形成完全的双链体，证实该片段在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。
5. 2. 5 基因扩增
首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。
整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。
主要步骤：将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。最后，将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。
常规PCR技术能扩增两引物之间的 DNA区段，然而，有时我们也希望 扩增位于靶DNA区段之外的未知 DNA序列，这就需要应用反向PCR （reverse PCR）技术。
先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸内切限制酶，从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。
5. 2. 6 DNA与蛋白质相互作用研究
1）凝胶阻滞试验：凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。
在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
2）DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）
首先将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。
加入少量DNaseI（随机切割DNA）消化DNA分子，保证平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。
如果有蛋白质结合到DNA分子的某一区段上，它就将保护该DNA区段免受DNaseI的消化作用，不能产生出相应长度的切割条带。
在电泳凝胶放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不出现放射性标记的条带，出现了被称为“足迹”的空白区。
课外作业了解主要分子生物学技术与方法。
5. 3 基因克隆的主要载体系统
5. 4 基因的分离与鉴定(初步了解)
5. 3. 1 质粒DNA及其分离纯化
细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。
1）氯化铯密度梯度离心法
质粒DNA仅占细胞总DNA的1%~2%，其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别。
实验表明，在DNA分离过程中，染色体DNA容易断裂成较小的线性片段，而质粒DNA由于其分子量较小、结构紧密，仍能保持完整状态。
在大肠杆菌裂解液中加入EtBr-氯化铯溶液，使EtBr分子嵌入到DNA链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的染色体DNA大片段及开环的质粒DNA分子具有游离的末端而易于解旋，可结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的DNA分子，只能发生有限的解旋反应，结合少量的EtBr分子。
在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体DNA片段具有更高的密度。
通过氯化铯密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。
2）碱变性法
在pH值12.0~12.5时加热DNA溶液，线性DNA会被变性，两条链完全分开。闭合环状质粒DNA不会被变性，尽管连接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链彼此盘绕，两条链仍然结合在一起。
致冷或恢复中性pH后，共价闭合环状的质粒DNA能迅速而准确地复性。
5. 3. 2 重要的大肠杆菌质粒载体
1）pSC101质粒载体
是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，编码有四环素抗性基因（tetr），具有EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单切割位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。