第一节 蛋白质概论
蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。
一、 蛋白质的化学组成与分类
1、 元素组成
碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25
2、 氨基酸组成
从化学结构上看，蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子。
3、 分类
（1）、 按组成：
简单蛋白：完全由氨基酸组成
结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基）
详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。
（2）、 按分子外形的对称程度：
球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。
纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。
（3）、 功能分：
酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。
4、 蛋白质在生物体内的分布
含量(干重) 微生物 50-80%
人 体 45%
一般细胞 50%
种类 大肠杆菌 3000种
人体 10万种
生物界 1010-1012
二、 蛋白质分子大小与分子量
蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。
P 76 表3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。）
蛋白质分子量= aa数目*110
对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。
三、 蛋白质分子的构象与结构层次
蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。
P77 图3-1，蛋白质分子的构象示意图。
一级结构 氨基酸顺序
二级结构 α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲
三级结构 α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段
四级结构 多亚基聚集
四、 蛋白质功能的多样性
细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。
1． 酶
2． 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）
3． 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4． 物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）
5． 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6． 激素功能（胰岛素）
7． 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）
8． 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9． 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
第二节 氨基酸
一、 蛋白质的水解(见P79)
氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。
酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基
碱水解：消旋，色氨酸稳定
酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能：
（1）、 组成蛋白质
（2）、 一些aa及其衍生物充当化学信号分子
g-amino butyric acid (g-氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。
Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroid gland产生的Tyr衍生物)和吲乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。
（3）、 氨基酸是许多含N分子的前体物
核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa
（4）、 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物
精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是排除它们的一种重要机制。
三、 氨基酸的结构与分类
1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150种)。
（一） 编码的蛋白质氨基酸（20种）
也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。
近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白质氨基酸。
结构通式：
不变部分，可变部分。L-型，羧酸的α-碳上接-NH2，，所以都是L-α-氨基酸。
α-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在200℃以上。
除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。
表 20种氨基酸结构
1、 按照R基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）：
（1）、 R为脂肪烃基的氨基酸（5种）
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、
图3-2
R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03）
P 92 表 3-7 （比较等电点。）
Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。
从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile 是这20 种a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3以外）。
（2）、 R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
含羟基的有两种：Ser和Thr。
图3-3
Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。
Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。
Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。
含硫的两种：Cys、Met
图3-4
Cys中R含巯基（-SH），Cys 具有两个重要性质：
（1）在较高pH值条件，巯基离解。
（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。
Cys—s—s—Cys
二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。
Cys还常常出现在酶的活性中心。
Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。
u Cys与结石
在细胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。
胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结石会导致疼疼、发炎甚至尿血。
大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。
青霉胺的结构
（3）、 R中含有酰胺基团（2种）
Asn、Gln
图3-5
酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义
（4）、 R中含有酸性基团（2种）
Asp、Glu，一般称酸性氨基酸
图3-6
Asp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25
它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。
（5）、 R中含碱性基团（3种）
Lys、Arg、His，一般称碱性氨基酸
图3-7
Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）
Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。
His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。
His含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。
（6）、 R中含有芳基的氨基酸（3种）
Phe、Try、Trp
图3-8
都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)或电子重叠复合物。在受体—底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。
这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，Trp＞Tyr＞Phe。
Phe疏水性最强.。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解。
Trp有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。
（7）、 R为环状的氨基酸（1种）
Pro，有时也把His、Trp归入此类。
图3-9
Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，
u 必需氨基酸：
成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe
婴儿期：Arg和His供给不足，属半必须氨基酸。
必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸）
2、 按照R基的极性性质(能否与水形成氢键)20种基本aa，可以分为4类：
侧链极性(疏水性程度)
Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0
Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0
Met 1.3 Gln -0.2 His 0.5
Pro 1.4 Thr 0.4
Val 1.5 Cys 1.0
Leu 1.8 Tyr 2.3
Ile 1.8
Phe 2.5
Trp 3.4
（1）、 非极性氨基酸
9种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸的R基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
（2）、 不带电何的极性氨基酸
6种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，Asn和Gln的-NH2很容易形成氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。
（3）、 带负电荷的aa(酸性aa)
2种，在pH6~7时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何。
（4）、 带正电何的aa(碱性aa)
3种，Arg、Lys、His。在pH7时带净正电荷。
当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，在pH7时约10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。
酶的活性中心：His、Ser、Cys
非极性aa一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。
（二） 非编码的蛋白质氨基酸
也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。
Prothrombin(凝血酶原)中含有g-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。
结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
图3-10 修饰aa的结构
（1）4-羟脯氨酸
（2）5-羟赖氨酸
这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。
（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）
(4)г-羧基谷氨酸
存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。
（5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中）
（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。
（三） 非蛋白质氨基酸
除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。
（1）L-型α –氨基酸的衍生物
L-瓜氨酸
图
L-鸟氨酸
图
（2）D-型氨基酸
D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）
（3）β-、γ-、δ-氨基酸
β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。
四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收
1、 氨基酸的构型
除Gly外，19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr和Ile的β-碳原子也是不对称的，因此Thr、Ile各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体。
图 P86 L-苏氨酸 D-苏氨酸 L-别一苏 D-别-苏
构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。
2、 旋光性
20种氨基酸中，只有Gly无手性碳。Thr、Ile各有两个手性碳。其余17种氨基酸的L型与D型互为镜象关系，互称光学异构体（对映体，或立体异构体）。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一））。另一个异构体可使偏振光顺时针旋转（计为（+）），称为旋光性。
光学异构体的其它理化性质完全相同。
外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。
L-苏氨酸和D-苏氨酸、L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸分别组成消旋物，而L-（D-）苏氨酸和L-（D-）别一苏氨酸则是非对映体。
旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合成氨基酸时也会得到无旋光性的D-、L-消旋物。。
内消旋物：分子内消旋
胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。
L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物
图 P86
L-胱氨酸 D-胱氨酸 内消旋胱氨酸：（分子内部互相抵消而无旋光性）
蛋白质中L型氨基酸的比旋光度
P 87 蛋白质中L型氨基酸的比旋光度。
氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关（PH值影响氨基和羧基的解离）。
3、 氨基酸的光吸收性
20种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（〈220nm〉均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有Tyr、Phe、Trp有吸收。
Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm紫外区有吸收。
λ（nm） ε
Tyr 275 1.4×103
Phe 257 2.0×102
Trp 280 5.6×103
Lambert-Beer：
五、 氨基酸的酸碱性质（重点）
1、 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在
α-氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点200-350℃，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。
三个现象：
①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。
②不溶于非极性溶剂→极性分子
③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）→水溶液中的氨基酸是极性分子。
原因：α-羧基pK1在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，当pH<8.0时，α-氨基以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。
Gly溶点232℃比相应的乙酸（16.5℃）、乙胺（-80.5℃）高，可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在。
图
2、 氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线
HA A- + H+
pH=pKa/ +Log[共轭碱]／[共轭酸] pOH=pKb/+Log[共轭酸]／[共轭碱]
（1）pH > pKa/ 时，[碱] > [酸]
pH = pKa/ 时，[碱] = [酸]
pH < pKa/ 时， [酸] > [碱]
（2） pKa/ 就是[碱] = [酸]时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+]
（3）当[碱] = [酸]时，溶液的pH值等于pKa/
（4）Gly的两性解离和滴定曲线
图3-14 Gly的滴定曲线
在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。
滴定开始时，溶液中主要是Gly+。
起点：100% Gly+ 净电荷：+1
第一拐点： 50%Gly + ，50%Gly± 平均净电荷：+0.5
第二拐点： 100%Gly± 净电荷：0 等电点pI
第三拐点： 50%Gly± ， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5
终点： 100% Gly- 净电荷：-1
第一拐点：pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]，pH=pK1=2.34
第二拐点：100%Gly±，净电荷为0，此时的pH值称氨基酸的等电点pI。
第三拐点：pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6
Gly的等电点：
等电点时：[Gly-]=[Gly+]
等电点时氢离子浓度用I表示
I2=K1·K2 PI=1/2(pK1+pK2)
氨基酸在等电点状态下，溶解度最小
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
以Gly为例
pH>2.34 正 +1.0 — +0.5
pH=2.34 正 +0.5
2.34<PH<5.97&NBSP;&NBSP;&NBSP;&NBSP; 0
5.97<PH<9.60&NBSP;&NBSP;&NBSP;&NBSP; — -0.5
pH>9.60 负 -0.5 — -1.0
问题：
（1）pH = pKa/ 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？
（2）pI的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例分析
（3）不同pH下的组成分析和电泳行为
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
（4）利用pI和pKa/确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围
（5）计算不同氨基酸水溶液的pH值
（6）绘制滴定曲线（Glu）
根据P92页表3-7中Glu的数据（pK1α-COOH 2.19， pK2α-N+H39.67，pKR R-COOH 4.25，pI 3.22）
①绘出滴定曲线
②指出Glu-和Glu=各一半时的pH值
③指出Glu总是带正电荷的pH范围
④指出Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围
①解：见图
②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67
③pH<3.22时 Glu总带正电荷
④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25左右
P92 表3-7，氨基酸的表观解离常数和等电点
①从表中（P92）可以看出，氨基酸的α-羧基pKa在1.8-2.6间，比典型羧基的pKa（如乙酸pKa为4.76）要小很多，说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强100倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的影响（场效应）。
图
②表中只有His的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷。
在生理条件下，只有His有缓冲能力。
血红蛋白中His含量高，在血液中具很强的缓冲能力。
六、 氨基酸的化学性质
（一） α-NH2参加的反应
1、 酰化反应
①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基保护剂。
②丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）
DNS—cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
图
N Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C →→→→ DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C
水解 DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe
DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。
③蛋白质的合成
图
④（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。
苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。
将经过匀浆的动物肝脏组织与Gly、苯甲酸和ATP混合保温，从混合液中可分离出N-苯甲酸一Gly。
图
苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。
2、 烷基化反应
α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。
①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分，它是Gly甲基化的产物：
图
②强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。
第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。
图
③Sanger反应（2.4一二硝基氟苯，DNFP）
图
二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。
④Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC）
图
苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） → 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸）
PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸
⑤生成西佛碱的反应（Schiff）
氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。
图
西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。
⑥含硫氨基酸的烷基化反应
硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。
生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met与ATP作用得到的S-烷基化产物。
图
在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成。
图
S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一个CH2）
（二） α-羧基参加的反应
①成盐、成酯
分别与碱、醇作用
②成酰氯的反应（使羧基活化）
氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯。
图
此反应使氨基酸的羧基活化，易与另一个氨基酸的氨基结合，在多肽的人工合成中常用。
（三） α-NH2和α-COOH共同参加的反应
1、 与茚三酮反应
茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。（λmax=570nm）
定性、定量。
（四） 侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰
（不作要求，只提一下，《陶慰孙》第四章）
七、 氨基酸的分离和分析
1、 电泳分离
电泳的基本原理
举例：Glu、Leu 、His 、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度。
Glu Leu His Lys
pI 3.22 5.98 7.59 9.74
图
2、 滤纸层析和薄层层析
分配原理
3、 离子交换层析分离氨基酸
磺酸型阳离子交换树脂
图
树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。
作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力
氨基酸分析仪
第三节 肽 peptide
一、 肽和肽键的结构
肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。
肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
由两个氨基酸形成的肽叫二肽，
少于10个氨基酸的肽叫寡肽，
多于10个氨基酸的肽叫多肽。
结构：P111上 5肽
主要重复单位：
侧链Ｒ：由不同的氨基酸残基构成
名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸
写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu或ＳＧＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu—Ala---Tyr---Gly---Ser。
肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。
图P111 下 肽键结构
结构１中，Ｃ－Ｎ单键长0.148nm
结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０.127nm
结构３中，Ｃ--Ｎ键长0.132nm，６个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
肽键结构介于１和２之间（结构3），是结构1和结构2之间的平均中间状态。Ｃ－Ｎ单键具有的40%的双键性质，C═O双键具有40%的单键性质。
（3）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．
图
二、 肽的重要性质
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
肽中的末端α－COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。
pK值改变的原因：
见Ｐ113、表３－８，比较表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly
Gly—Glu—Lys—Ala的解离：
图 P113
pH 占优势离子的净电荷：
<3.5 +2
3.5-4.5 +1
4.5-7.8 0
7.8-10.2 -1
>10.2 -2
注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。
问题1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。
图
将Ｒ＋＋— 变成Ｒ＋—，就必须考虑R＋—与R（+ ，+ ，-1）等同，即侧链—N+H3解离50%，此时
图
Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离，它的R+-实际相对于R（+ ，+ ，+ ， -1 ），此时每个侧链解离后带有 1/3个正电荷。
问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）
多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。
多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。
3、 肽的化学反应
和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。
图
三、 天然存在的活性肽
生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。
生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。
很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。
1、 谷胱甘肽 Glu—Cys—Gly
广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。
2GSH GS—SG
H2O2 + 2GSH 2H2O + GS—SG
2、 短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。
L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 脑啡肽（5肽）
已发现几十种
Met--- 脑啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
Leu----脑啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。
1982年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
《神经生物化学》 神经多肽
生物体内多肽或寡肽的来源：
①合成蛋白质的剪切、修饰
②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③动物肠道可吸收寡肽
第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
一、 蛋白质结构层次
一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
二级结构
↓
超二级结构
↓
构象（高级结构） 结构域
↓
三级结构(球状结构)
↓
四级结构(多亚基聚集体)
一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)
二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。
超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。
结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。
或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。
四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。
单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。
RNase
单条肽链 肌红蛋白
单体蛋白 胰岛素
多条肽链 胰凝乳蛋白酶
蛋白质
相同亚基 一种乳酸脱氢酶α4
寡聚蛋白
不同亚基 血红蛋白α2β2
蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。
二、 一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合生成的。
⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。
⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。
⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个α-NH2 和α-COOH
⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。
三、 ．蛋白质一级结构测定
推断 预测
氨基酸序列（一级结构） → 空间结构 （高级结构） → 功能
（一） 蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 测定多肽链的氨基酸组成。
（4） 断裂链内二硫键。
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
N C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4
B 法裂解 B1 B2 B3 B4
用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、 测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法：凝胶过滤法、沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化：
—S—S—+HCOOOH → SO3H
β巯基乙醇还原：
举例:： 血红蛋白 (α2β2)
（注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
分子量： M
拆亚基： M1 、M2 两条带
拆二硫键： M1 、M2 两条带
分子量关系： M = 2M1 + 2M2
4、 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
②Cys 测定
5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1、 化学裂解法
①溴化氰 —Met—X— 产率85%
②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100%
③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
④羟胺NH2OH —Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys X
(X ≠ Pro)
Arg—— X
②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X
(X ≠ Pro)
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶 Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶 Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys
⑥Pro蛋白酶 Pro——X
3、 肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
4、 肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接
1、 Edman法
一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D……
（2）裂解
PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D
（3）转化
ATZ—A PTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
耦联：得PTC肽
一次循环 裂解：ATZ- a.a
转化：PTH-a.a
反应产率 99％ 循环次数 120
(偶联、降 98% 60
解两步） 90% 40
2、 DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图
3、 有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
4、 用自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
用Polybrene反应器。
（聚阳离子）四级铵盐聚合物
液相：5nmol 20-40肽 97%
气相：5pmol 60 肽 98%
5、 肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
1、 二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽，测序
与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2、 酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷
脂类：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白质的一级结构与生物功能
（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例：
（1） 牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128 图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7
A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）
P128 图3-39
分子量：12600
124个a.a残基
4个链内二硫键。
牛胰RNase变性一复性实验：
P164 图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。
（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构
P129 图3-40
（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
1、 细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130，图3-41
分子量：12500左右
氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩 0
人与猴 1
人与狗 10
人与酵母 44
2、 胰岛素
祥见 P175 胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
（三） 蛋白质一级结构的个体差异—分子病
分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的a链和两条相同的b链组成a2b2，镰刀形红细胞中，血红蛋白b链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白
正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血 β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10 Glu-
疏水 亲水
人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活
一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
1、 血液凝固的机理
凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原 凝血酶
纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶
（1）、 凝血酶原
P133 图3-43 凝血酶原的结构糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
A链49 a.a
B链259 a.a
（2）、 纤维蛋白原
P133 图3-44 纤维蛋白原的结构
α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸
在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。
P133 纤维肽A .B的结构
A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。
P134上
在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
2、 胰岛素原的激活
P134图3-45
胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
五、 多肽与蛋白质的人工合成
在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。
P139图3-46 多肽的固相合成
C端 N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合
第五节 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
一、 肽链的构象
多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
1、 肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
2、 多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P144表3-12 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
P145 拉氏构象图（Gly除外）
⑴实线封闭区域
一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域
是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域
是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二、 二级结构的基本类型
驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1、 α螺旋
（1）、 α螺旋及其特征
在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋
回忆 P143图3-52
② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
图
这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。
2.27螺旋（n=1）
310 螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
2.27 310 3.613 4.316
n=1 n=2 n=3 n=4
α-螺旋 π-螺旋
（2）、 R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
（3）、 pH对α—螺旋的影响
多聚L-Glu和多聚L-Lys
P149 图3-57
（4）、 右手α-螺旋与左手α-螺旋
图 P148
右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。
（5）、 α-螺旋结构的旋光性
由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
（6）、 α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性
一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速
2、 β-折叠
P149 图3—58 P150 图3—59
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同
平行式：φ=-119° Ψ=+113°
反平行式：φ=-139° Ψ=+135°
从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。
在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。
3、 β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）
β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
4、 无规卷曲
没有规律的多肽链主链骨架构象。
球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。
α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。
三、 超二级结构
由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
1、 αα结构（复绕α-螺旋）
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。
p153 图3-61 A
存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
2、 βxβ结构
两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。
①βcβ
x为无规卷曲
p153 图3-61 B
②βαβ
x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
p153 图3-61 C
3、 β曲折（β-meander）
由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。
P153图3-61 D
4、 回形拓扑结构（希腊钥匙）
P153图3-61 E
5、 β-折叠桶
由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。
超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。
6、 α-螺旋-β转角-α-螺旋
两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。
λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。
四、 纤维状蛋白质
纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。
1、 角蛋白
源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。
（1）、 α-角蛋白
P155 图3-63，P156 图3-64
主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微
结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。
？a-角蛋白(a-Keratin)中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一个II型多肽链形成一个卷曲螺旋二聚体(Coiled coil dimmer)。一对卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋结构称原纤维(Protofilament，4股右手a-螺旋)，原纤维的亚基间以氢键和二硫键相连。4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将纤维(fiber)含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？
（2）、 β-角蛋白
P157 图3-65
含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主。
丝心蛋白取片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
2、 胶原蛋白
3、 弹性蛋白
4、 肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白
第六节 球状蛋白质的高级结构与功能
前面讲了蛋白质结构的两个较低级的组织水平：一级结构和二级结构（包括超二级结构），本节讲述蛋白质（主要是球蛋白）的高级结构：结构域、三级结构、四级结构，及其与生物功能。
一、 蛋白质的一级结构决定高级结构
蛋白质功能的复杂性和多样性是建立在结构多样性的基础上。
多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当的顺序时，能自发形成α-螺旋和β-折叠，并处于稳定状态。
而多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。
同源蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。
RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我装配”。
P164 图3-69 RNase的变性与复性示意图二、 球状蛋白质的结构域、三级结构与功能
（一） 结构域
结构域(domain)，又称motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。
对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，就是说这些蛋白质是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基，结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
每个结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是活性部位，也是反应物的出入口。一般情况下，酶的活性部位位于两个结构域的裂缝中。
EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构
锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn
亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，
图5.19
（二） 三级结构：
三级结构：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。
或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。
1、 三级结构有以下特点：
 许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。
‚ 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。
ƒ 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体，典型情况下常常含有特定的功能(如结合离子和小分子)
2、 维持三级结构的作用力：
P164 图3-70
（1）氢键
大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋、β-折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）
包括三种弱的作用力：
定向效应 极性基团间
诱导效应 极性与非极性基团间
分散效应 非极性基团间
（3）疏水相互作用
蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。
（4）离子键（盐键）
是正电贺和负电荷之间的一种静电作用。
生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Ｌys、Arg、His离解成正离子。多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相反电荷的测链在分子的疏水内部形成盐键。
（5）共价健，主要的是二硫键，
在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。
6、静电相互作用
最强的静电作用就是带相反电何的离子基因间的静电作用，又称盐桥。盐桥和较弱的静电相互作用(离子-偶级、偶级-偶级、范德华力)也是维持亚基间以及蛋白质与配体间的作用力。
蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。
一、 蛋白质的化学组成与分类
1、 元素组成
碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25
2、 氨基酸组成
从化学结构上看，蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子。
3、 分类
（1）、 按组成：
简单蛋白：完全由氨基酸组成
结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基）
详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。
（2）、 按分子外形的对称程度：
球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。
纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。
（3）、 功能分：
酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。
4、 蛋白质在生物体内的分布
含量(干重) 微生物 50-80%
人 体 45%
一般细胞 50%
种类 大肠杆菌 3000种
人体 10万种
生物界 1010-1012
二、 蛋白质分子大小与分子量
蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。
P 76 表3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。）
蛋白质分子量= aa数目*110
对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。
三、 蛋白质分子的构象与结构层次
蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。
P77 图3-1，蛋白质分子的构象示意图。
一级结构 氨基酸顺序
二级结构 α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲
三级结构 α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段
四级结构 多亚基聚集
四、 蛋白质功能的多样性
细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。
1． 酶
2． 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）
3． 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4． 物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）
5． 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6． 激素功能（胰岛素）
7． 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）
8． 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9． 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
第二节 氨基酸
一、 蛋白质的水解(见P79)
氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。
酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基
碱水解：消旋，色氨酸稳定
酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能：
（1）、 组成蛋白质
（2）、 一些aa及其衍生物充当化学信号分子
g-amino butyric acid (g-氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。
Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroid gland产生的Tyr衍生物)和吲乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。
（3）、 氨基酸是许多含N分子的前体物
核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa
（4）、 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物
精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是排除它们的一种重要机制。
三、 氨基酸的结构与分类
1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150种)。
（一） 编码的蛋白质氨基酸（20种）
也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。
近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白质氨基酸。
结构通式：
不变部分，可变部分。L-型，羧酸的α-碳上接-NH2，，所以都是L-α-氨基酸。
α-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在200℃以上。
除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。
表 20种氨基酸结构
1、 按照R基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）：
（1）、 R为脂肪烃基的氨基酸（5种）
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、
图3-2
R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03）
P 92 表 3-7 （比较等电点。）
Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。
从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile 是这20 种a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3以外）。
（2）、 R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
含羟基的有两种：Ser和Thr。
图3-3
Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。
Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。
Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。
含硫的两种：Cys、Met
图3-4
Cys中R含巯基（-SH），Cys 具有两个重要性质：
（1）在较高pH值条件，巯基离解。
（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。
Cys—s—s—Cys
二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。
Cys还常常出现在酶的活性中心。
Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。
u Cys与结石
在细胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。
胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结石会导致疼疼、发炎甚至尿血。
大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。
青霉胺的结构
（3）、 R中含有酰胺基团（2种）
Asn、Gln
图3-5
酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义
（4）、 R中含有酸性基团（2种）
Asp、Glu，一般称酸性氨基酸
图3-6
Asp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25
它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。
（5）、 R中含碱性基团（3种）
Lys、Arg、His，一般称碱性氨基酸
图3-7
Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）
Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。
His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。
His含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。
（6）、 R中含有芳基的氨基酸（3种）
Phe、Try、Trp
图3-8
都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)或电子重叠复合物。在受体—底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。
这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，Trp＞Tyr＞Phe。
Phe疏水性最强.。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解。
Trp有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。
（7）、 R为环状的氨基酸（1种）
Pro，有时也把His、Trp归入此类。
图3-9
Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，
u 必需氨基酸：
成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe
婴儿期：Arg和His供给不足，属半必须氨基酸。
必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸）
2、 按照R基的极性性质(能否与水形成氢键)20种基本aa，可以分为4类：
侧链极性(疏水性程度)
Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0
Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0
Met 1.3 Gln -0.2 His 0.5
Pro 1.4 Thr 0.4
Val 1.5 Cys 1.0
Leu 1.8 Tyr 2.3
Ile 1.8
Phe 2.5
Trp 3.4
（1）、 非极性氨基酸
9种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸的R基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
（2）、 不带电何的极性氨基酸
6种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，Asn和Gln的-NH2很容易形成氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。
（3）、 带负电荷的aa(酸性aa)
2种，在pH6~7时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何。
（4）、 带正电何的aa(碱性aa)
3种，Arg、Lys、His。在pH7时带净正电荷。
当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，在pH7时约10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。
酶的活性中心：His、Ser、Cys
非极性aa一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。
（二） 非编码的蛋白质氨基酸
也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。
Prothrombin(凝血酶原)中含有g-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。
结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
图3-10 修饰aa的结构
（1）4-羟脯氨酸
（2）5-羟赖氨酸
这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。
（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）
(4)г-羧基谷氨酸
存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。
（5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中）
（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。
（三） 非蛋白质氨基酸
除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。
（1）L-型α –氨基酸的衍生物
L-瓜氨酸
图
L-鸟氨酸
图
（2）D-型氨基酸
D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）
（3）β-、γ-、δ-氨基酸
β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。
四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收
1、 氨基酸的构型
除Gly外，19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr和Ile的β-碳原子也是不对称的，因此Thr、Ile各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体。
图 P86 L-苏氨酸 D-苏氨酸 L-别一苏 D-别-苏
构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。
2、 旋光性
20种氨基酸中，只有Gly无手性碳。Thr、Ile各有两个手性碳。其余17种氨基酸的L型与D型互为镜象关系，互称光学异构体（对映体，或立体异构体）。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一））。另一个异构体可使偏振光顺时针旋转（计为（+）），称为旋光性。
光学异构体的其它理化性质完全相同。
外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。
L-苏氨酸和D-苏氨酸、L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸分别组成消旋物，而L-（D-）苏氨酸和L-（D-）别一苏氨酸则是非对映体。
旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合成氨基酸时也会得到无旋光性的D-、L-消旋物。。
内消旋物：分子内消旋
胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。
L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物
图 P86
L-胱氨酸 D-胱氨酸 内消旋胱氨酸：（分子内部互相抵消而无旋光性）
蛋白质中L型氨基酸的比旋光度
P 87 蛋白质中L型氨基酸的比旋光度。
氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关（PH值影响氨基和羧基的解离）。
3、 氨基酸的光吸收性
20种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（〈220nm〉均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有Tyr、Phe、Trp有吸收。
Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm紫外区有吸收。
λ（nm） ε
Tyr 275 1.4×103
Phe 257 2.0×102
Trp 280 5.6×103
Lambert-Beer：
五、 氨基酸的酸碱性质（重点）
1、 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在
α-氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点200-350℃，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。
三个现象：
①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。
②不溶于非极性溶剂→极性分子
③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）→水溶液中的氨基酸是极性分子。
原因：α-羧基pK1在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，当pH<8.0时，α-氨基以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。
Gly溶点232℃比相应的乙酸（16.5℃）、乙胺（-80.5℃）高，可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在。
图
2、 氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线
HA A- + H+
pH=pKa/ +Log[共轭碱]／[共轭酸] pOH=pKb/+Log[共轭酸]／[共轭碱]
（1）pH > pKa/ 时，[碱] > [酸]
pH = pKa/ 时，[碱] = [酸]
pH < pKa/ 时， [酸] > [碱]
（2） pKa/ 就是[碱] = [酸]时溶液的pH值，Ka/就是此时溶液的[H+]
（3）当[碱] = [酸]时，溶液的pH值等于pKa/
（4）Gly的两性解离和滴定曲线
图3-14 Gly的滴定曲线
在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。
滴定开始时，溶液中主要是Gly+。
起点：100% Gly+ 净电荷：+1
第一拐点： 50%Gly + ，50%Gly± 平均净电荷：+0.5
第二拐点： 100%Gly± 净电荷：0 等电点pI
第三拐点： 50%Gly± ， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5
终点： 100% Gly- 净电荷：-1
第一拐点：pH=pK+lg[Gly±]/[Gly+]，pH=pK1=2.34
第二拐点：100%Gly±，净电荷为0，此时的pH值称氨基酸的等电点pI。
第三拐点：pH=pK2+lg[Gly-]/[Gly±]=pK2=9.6
Gly的等电点：
等电点时：[Gly-]=[Gly+]
等电点时氢离子浓度用I表示
I2=K1·K2 PI=1/2(pK1+pK2)
氨基酸在等电点状态下，溶解度最小
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
以Gly为例
pH>2.34 正 +1.0 — +0.5
pH=2.34 正 +0.5
2.34<PH<5.97&NBSP;&NBSP;&NBSP;&NBSP; 0
5.97<PH<9.60&NBSP;&NBSP;&NBSP;&NBSP; — -0.5
pH>9.60 负 -0.5 — -1.0
问题：
（1）pH = pKa/ 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？
（2）pI的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例分析
（3）不同pH下的组成分析和电泳行为
pH > pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO-，向正极移动。
pH = pI时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小
pH < pI时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。
（4）利用pI和pKa/确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围
（5）计算不同氨基酸水溶液的pH值
（6）绘制滴定曲线（Glu）
根据P92页表3-7中Glu的数据（pK1α-COOH 2.19， pK2α-N+H39.67，pKR R-COOH 4.25，pI 3.22）
①绘出滴定曲线
②指出Glu-和Glu=各一半时的pH值
③指出Glu总是带正电荷的pH范围
④指出Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围
①解：见图
②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67
③pH<3.22时 Glu总带正电荷
④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25左右
P92 表3-7，氨基酸的表观解离常数和等电点
①从表中（P92）可以看出，氨基酸的α-羧基pKa在1.8-2.6间，比典型羧基的pKa（如乙酸pKa为4.76）要小很多，说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强100倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的影响（场效应）。
图
②表中只有His的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷。
在生理条件下，只有His有缓冲能力。
血红蛋白中His含量高，在血液中具很强的缓冲能力。
六、 氨基酸的化学性质
（一） α-NH2参加的反应
1、 酰化反应
①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基保护剂。
②丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）
DNS—cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
图
N Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C →→→→ DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C
水解 DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe
DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。
③蛋白质的合成
图
④（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。
苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。
将经过匀浆的动物肝脏组织与Gly、苯甲酸和ATP混合保温，从混合液中可分离出N-苯甲酸一Gly。
图
苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。
2、 烷基化反应
α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。
①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分，它是Gly甲基化的产物：
图
②强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。
第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。
图
③Sanger反应（2.4一二硝基氟苯，DNFP）
图
二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。
④Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC）
图
苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） → 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸）
PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸
⑤生成西佛碱的反应（Schiff）
氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。
图
西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。
⑥含硫氨基酸的烷基化反应
硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。
生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met与ATP作用得到的S-烷基化产物。
图
在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成。
图
S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一个CH2）
（二） α-羧基参加的反应
①成盐、成酯
分别与碱、醇作用
②成酰氯的反应（使羧基活化）
氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯。
图
此反应使氨基酸的羧基活化，易与另一个氨基酸的氨基结合，在多肽的人工合成中常用。
（三） α-NH2和α-COOH共同参加的反应
1、 与茚三酮反应
茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。（λmax=570nm）
定性、定量。
（四） 侧链R基参加的反应——用于蛋白质的化学修饰
（不作要求，只提一下，《陶慰孙》第四章）
七、 氨基酸的分离和分析
1、 电泳分离
电泳的基本原理
举例：Glu、Leu 、His 、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度。
Glu Leu His Lys
pI 3.22 5.98 7.59 9.74
图
2、 滤纸层析和薄层层析
分配原理
3、 离子交换层析分离氨基酸
磺酸型阳离子交换树脂
图
树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。
作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力
氨基酸分析仪
第三节 肽 peptide
一、 肽和肽键的结构
肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。
肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
由两个氨基酸形成的肽叫二肽，
少于10个氨基酸的肽叫寡肽，
多于10个氨基酸的肽叫多肽。
结构：P111上 5肽
主要重复单位：
侧链Ｒ：由不同的氨基酸残基构成
名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸
写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu或ＳＧＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu—Ala---Tyr---Gly---Ser。
肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。
图P111 下 肽键结构
结构１中，Ｃ－Ｎ单键长0.148nm
结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０.127nm
结构３中，Ｃ--Ｎ键长0.132nm，６个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。
肽键结构介于１和２之间（结构3），是结构1和结构2之间的平均中间状态。Ｃ－Ｎ单键具有的40%的双键性质，C═O双键具有40%的单键性质。
（3）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．
图
二、 肽的重要性质
1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作用，也具有旋光性。
2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
在pH0―14范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
肽中的末端α－COOH pK值比游离 a.a中的大一些，而末端α－Ｎ＋Ｈ３的pK值比游离氨基酸中的小一些，R基变化不大。
pK值改变的原因：
见Ｐ113、表３－８，比较表３－８中Gly-Gly和Gly-Gly-Gly
Gly—Glu—Lys—Ala的解离：
图 P113
pH 占优势离子的净电荷：
<3.5 +2
3.5-4.5 +1
4.5-7.8 0
7.8-10.2 -1
>10.2 -2
注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。
问题1：求出二肽Lys—Lys 及三肽Lys—Lys—Lys的pI值。
图
将Ｒ＋＋— 变成Ｒ＋—，就必须考虑R＋—与R（+ ，+ ，-1）等同，即侧链—N+H3解离50%，此时
图
Lys-Lys-Lys分子中有三个侧链可解离，它的R+-实际相对于R（+ ，+ ，+ ， -1 ），此时每个侧链解离后带有 1/3个正电荷。
问题2：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）
多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。
多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。
3、 肽的化学反应
和游离氨基酸一样，肽的α—羧基，α—氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。
图
三、 天然存在的活性肽
生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。
生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。
活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。
很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。
1、 谷胱甘肽 Glu—Cys—Gly
广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。
2GSH GS—SG
H2O2 + 2GSH 2H2O + GS—SG
2、 短杆菌肽（抗生素）
由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。
L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe —L-Pro—L-Val
3、 脑啡肽（5肽）
已发现几十种
Met--- 脑啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Met
Leu----脑啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu
具有镇痛作用。
1982年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了Leu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。
《神经生物化学》 神经多肽
生物体内多肽或寡肽的来源：
①合成蛋白质的剪切、修饰
②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、
③动物肠道可吸收寡肽
第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
一、 蛋白质结构层次
一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
二级结构
↓
超二级结构
↓
构象（高级结构） 结构域
↓
三级结构(球状结构)
↓
四级结构(多亚基聚集体)
一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)
二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有α-螺旋、β折叠、β-转角、无规卷曲。
超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ。
结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。
三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。
或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。
四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。
单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。
RNase
单条肽链 肌红蛋白
单体蛋白 胰岛素
多条肽链 胰凝乳蛋白酶
蛋白质
相同亚基 一种乳酸脱氢酶α4
寡聚蛋白
不同亚基 血红蛋白α2β2
蛋白质一级结构(序列)中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。
二、 一级结构的要点
蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。
一级结构要点：
⑴蛋白质中的肽键都是由α-NH2和α-COOH结合生成的。
⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。
⑶氨基酸的α-NH2和α-COOH缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。
⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个α-NH2 和α-COOH
⑸分子量大于5000的活性肽才能称为蛋白质。
三、 ．蛋白质一级结构测定
推断 预测
氨基酸序列（一级结构） → 空间结构 （高级结构） → 功能
（一） 蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3） 测定多肽链的氨基酸组成。
（4） 断裂链内二硫键。
（5） 分析多肽链的N末端和C末端。
（6） 多肽链部分裂解成肽段。
（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序
（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。
（9） 确定多肽链中二硫键的位置。
（二） 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
1、 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
N C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4
B 法裂解 B1 B2 B3 B4
用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
（三） 测序前的准备工作
1、 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、 测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法：凝胶过滤法、沉降系数法
3、 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化：
—S—S—+HCOOOH → SO3H
β巯基乙醇还原：
举例:： 血红蛋白 (α2β2)
（注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
分子量： M
拆亚基： M1 、M2 两条带
拆二硫键： M1 、M2 两条带
分子量关系： M = 2M1 + 2M2
4、 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
②Cys 测定
5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm
5、 端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
1、 化学裂解法
①溴化氰 —Met—X— 产率85%
②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100%
③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
④羟胺NH2OH —Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次
2、 酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys X
(X ≠ Pro)
Arg—— X
②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X
(X ≠ Pro)
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶 Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶 Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys
⑥Pro蛋白酶 Pro——X
3、 肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
4、 肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法
要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接
1、 Edman法
一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D……
（2）裂解
PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D
（3）转化
ATZ—A PTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
耦联：得PTC肽
一次循环 裂解：ATZ- a.a
转化：PTH-a.a
反应产率 99％ 循环次数 120
(偶联、降 98% 60
解两步） 90% 40
2、 DNS-Edman法
用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图
3、 有色Edman法
荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
4、 用自动序列分析仪测序
仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
用Polybrene反应器。
（聚阳离子）四级铵盐聚合物
液相：5nmol 20-40肽 97%
气相：5pmol 60 肽 98%
5、 肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
1、 二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质
第一向电泳
过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳
分离出含二硫键的两条短肽，测序
与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
2、 酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
3、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷
脂类：Ser、 Thr、Cys
磷酸：Ser、 Thr、His
经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
四、 蛋白质的一级结构与生物功能
（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能
蛋白质一级结构举例：
（1） 牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128 图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7
A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）
P128 图3-39
分子量：12600
124个a.a残基
4个链内二硫键。
牛胰RNase变性一复性实验：
P164 图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。
（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构
P129 图3-40
（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化
同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
1、 细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130，图3-41
分子量：12500左右
氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩 0
人与猴 1
人与狗 10
人与酵母 44
2、 胰岛素
祥见 P175 胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
（三） 蛋白质一级结构的个体差异—分子病
分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的a链和两条相同的b链组成a2b2，镰刀形红细胞中，血红蛋白b链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白
正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血 β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10 Glu-
疏水 亲水
人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活
一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
1、 血液凝固的机理
凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原 凝血酶
纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶
（1）、 凝血酶原
P133 图3-43 凝血酶原的结构糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
A链49 a.a
B链259 a.a
（2）、 纤维蛋白原
P133 图3-44 纤维蛋白原的结构
α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸
在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。
P133 纤维肽A .B的结构
A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。
P134上
在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
2、 胰岛素原的激活
P134图3-45
胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
五、 多肽与蛋白质的人工合成
在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。
P139图3-46 多肽的固相合成
C端 N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合
第五节 蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质
二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
一、 肽链的构象
多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
1、 肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
2、 多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P144表3-12 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
P145 拉氏构象图（Gly除外）
⑴实线封闭区域
一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域
是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域
是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二、 二级结构的基本类型
驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
1、 α螺旋
（1）、 α螺旋及其特征
在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋
回忆 P143图3-52
② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
图
这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。
2.27螺旋（n=1）
310 螺旋（n=2，Φ= -49°, Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
2.27 310 3.613 4.316
n=1 n=2 n=3 n=4
α-螺旋 π-螺旋
（2）、 R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
（3）、 pH对α—螺旋的影响
多聚L-Glu和多聚L-Lys
P149 图3-57
（4）、 右手α-螺旋与左手α-螺旋
图 P148
右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。
（5）、 α-螺旋结构的旋光性
由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
（6）、 α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性
一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速
2、 β-折叠
P149 图3—58 P150 图3—59
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同
平行式：φ=-119° Ψ=+113°
反平行式：φ=-139° Ψ=+135°
从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。
在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。
3、 β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）
β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
4、 无规卷曲
没有规律的多肽链主链骨架构象。
球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。
α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。
三、 超二级结构
由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
1、 αα结构（复绕α-螺旋）
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。
p153 图3-61 A
存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
2、 βxβ结构
两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。
①βcβ
x为无规卷曲
p153 图3-61 B
②βαβ
x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
p153 图3-61 C
3、 β曲折（β-meander）
由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。
P153图3-61 D
4、 回形拓扑结构（希腊钥匙）
P153图3-61 E
5、 β-折叠桶
由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。
超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。
6、 α-螺旋-β转角-α-螺旋
两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。
λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。
四、 纤维状蛋白质
纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。
1、 角蛋白
源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。
（1）、 α-角蛋白
P155 图3-63，P156 图3-64
主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微
结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。
？a-角蛋白(a-Keratin)中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一个II型多肽链形成一个卷曲螺旋二聚体(Coiled coil dimmer)。一对卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋结构称原纤维(Protofilament，4股右手a-螺旋)，原纤维的亚基间以氢键和二硫键相连。4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将纤维(fiber)含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？
（2）、 β-角蛋白
P157 图3-65
含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主。
丝心蛋白取片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
2、 胶原蛋白
3、 弹性蛋白
4、 肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白
第六节 球状蛋白质的高级结构与功能
前面讲了蛋白质结构的两个较低级的组织水平：一级结构和二级结构（包括超二级结构），本节讲述蛋白质（主要是球蛋白）的高级结构：结构域、三级结构、四级结构，及其与生物功能。
一、 蛋白质的一级结构决定高级结构
蛋白质功能的复杂性和多样性是建立在结构多样性的基础上。
多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当的顺序时，能自发形成α-螺旋和β-折叠，并处于稳定状态。
而多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。
同源蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。
RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我装配”。
P164 图3-69 RNase的变性与复性示意图二、 球状蛋白质的结构域、三级结构与功能
（一） 结构域
结构域(domain)，又称motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。
对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，就是说这些蛋白质是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基，结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
每个结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是活性部位，也是反应物的出入口。一般情况下，酶的活性部位位于两个结构域的裂缝中。
EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构
锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn
亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，
图5.19
（二） 三级结构：
三级结构：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。
或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。
1、 三级结构有以下特点：
 许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。
‚ 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。
ƒ 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体，典型情况下常常含有特定的功能(如结合离子和小分子)
2、 维持三级结构的作用力：
P164 图3-70
（1）氢键
大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋、β-折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）
包括三种弱的作用力：
定向效应 极性基团间
诱导效应 极性与非极性基团间
分散效应 非极性基团间
（3）疏水相互作用
蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。
（4）离子键（盐键）
是正电贺和负电荷之间的一种静电作用。
生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Ｌys、Arg、His离解成正离子。多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相反电荷的测链在分子的疏水内部形成盐键。
（5）共价健，主要的是二硫键，
在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。
6、静电相互作用
最强的静电作用就是带相反电何的离子基因间的静电作用，又称盐桥。盐桥和较弱的静电相互作用(离子-偶级、偶级-偶级、范德华力)也是维持亚基间以及蛋白质与配体间的作用力。
