鉴定反应
吲哚实验与硫化氢实验是常用的两个鉴定实验
1、吲哚实验：有些细菌可以分解色氨酸生成吲哚可以与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种。
2、硫化氢实验：许多细菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，如果在蛋白胨培养基中加进重金属盐，接种细菌培养后观察，若产生硫化氢，则出现黑色的硫化铅或硫化铁。
3节：合成代谢
一、生物合成三要素
能量 、还原力、 小分子前体物
1、能量由ATP供给，ATP产生有三种方式（底物水平磷酸化，氧化磷酸化，光合磷酸化）
2、还原力产生：还原力主要指NADH2 和NADPH2
EMP 与TCA 产生的NADH2有3个去向：
1）供H体（中间产物还原成发酵产物）；
2）通过呼吸链产生ATP；
3）用于细胞物质合成。
但NADH2要先在转氢酶作用下转变成NADPH2才能用。
NADP+ NADH2 NADPH2+NAD
在体内还有HMP供给NADPH2与磷酸糖 。
1G 2 NADPH2+CO2+5-P-核酮糖
NADPH2在光细菌中可通过非环式光合磷酸化方式产生。
3、小分子前体物：通常指糖代谢过程中产生的中间代谢物，有12 种。
代谢回补顺序
1、合成草酰乙酸（OA）回补顺序
PEP+CO2 羧化酶 OA+Pi
PY+CO2+ATP 羧化酶 OA+ADP+Pi
PEP+CO2+GDP 羧化激酶 OA+GTP
PY+CO2+NADH2 苹果酸酶 苹果酸+NAD
á-KD+CO2+NADH2 脱氢酶 异柠檬酸+NAD
好氧性，利用乙酸微生物，以乙醛酸循环补充草酰乙酸。
2、合成PEP的回补顺序
PY+ATP PEP合酶 PEP+ADP+Pi
PY+ATP+Pi PY双激酶 PEP+AMP+Ppi
OA+GTP PEP羧激酶 PEP+GDP+CO2
OA+PPi PEP羧转磷酸酶 PEP+Pi+CO2
综合总结：
二、糖类合成
（一）单糖合成
1、卡尔文环Calvin cycle（光合菌、某些自养菌）
（还原的磷酸戊糖环）分为三个阶段：
①CO2固定②固定CO2的还原③CO2受体的再生。
关键酶：1，5-二磷酸核酮糖羧化酶、磷酸核酮糖激酶。
总反应式：
6CO2+6H2O+18ATP+12NADPH2 G+18ADP+12NADP+18Pi
另外，产甲烷细菌有厌氧乙酰辅酶A途径，少数光合细菌中有还原性TCA途径等新的自养CO2固定途径。
2、EMP逆过程。
3、糖异生作用。
4、糖互变作用：大量是在核苷二磷酸糖水平上进行。
（二）多糖合成
E.coli肽聚糖合成：需1个多糖引物。
1、单糖组分在细胞质中合成(UDP是第一个载体）
2、逐步加上AA生成UDP-NAM-五肽（Park 核苷酸），顺序为L-Lys, D-Glu, DAP, D-Ala, D-Ala ( 不需tRNA参与）。其中，2D-Ala D-丙酰-D-Ala(青霉素类似）
此阶段在细胞质中进行。
3、 UDP-NAM-五肽转至膜上，与一脂质载体（细菌萜醇 —C55类异戊二烯醇）结合，释放出NAM-五肽焦磷脂，在膜内侧与UDP-NAG结合，构成肽聚糖亚单位。
细菌萜醇是第二个载体。
4、亚单位转移至细胞壁的生长点上（插入），万古霉素、杆菌肽抑制。
5、在细胞膜外侧，亚单位与引物相连（转糖基作用），再通过转肽酶作用，将亚单位末端的D-丙-D-丙拆开，第四个AA与另一亚单位的DAP之间交联，另一D-Ala释放。
在这一步，由于青霉素是D-丙-D-丙的结构类似物，则转肽酶被抑制，造成肽链间无法交联，网状结构也连不起来，形成 “软壁 ”，极易破裂死亡。青霉素只对正生长菌起作用，对静息细胞无作用。
三、氮类物质合成
（一）生物固氮
分子N2通过固氮微生物作用形成NH3的过程。
1、固氮微生物 （都是原核微生物）
①自生固氮菌：好氧、厌氧、兼性厌氧及各种营养类型。
②共生固氮菌：与豆科共生为根瘤菌，与非豆科共生是放线菌。
③联合固氮菌：根际、叶面微生物。
2、固氮机制
只有在不含有化合态氮的培养基上生长，且提供ATP、还原力等条件下才能固氮。
总反应式： Mg2+
N2+6e+6H++12ATP 2NH3+12ADP+12Pi
固氮酶
固氮酶 组分Ⅰ：钼铁蛋白（MoFd）
组分Ⅱ：铁蛋白（AzoFd)
都对氧极敏感，遇氧失活，需厌氧条件固氮。
固氮过程：
电子载体：铁氧还蛋白（Fd），黄素氧还蛋白（Fld）也可以。
每步只传递2e，N2 2NH3需6e，连续三次。
固氮酶底物专一性不高，还能催化一些反应。
C2H2→C2H4，
N2O→N2+H2O，
HCN→CH4+NH3+CH3NH2，
2H+→H2。
其中C2H2→C2H4 ，可用气相色谱检测，可作为固氮系统存在的有效指标。
N2 2NH3去路：自生固氮菌不能储存，也不分泌，很快同化；共生固氮菌分泌至根瘤细胞中为植物所利用。
（二）氨基酸合成
1、直接从培养基中吸收。
2、通过转氨作用合成其他的氨基酸：
Glu + 丙酮酸 α-酮戊二酸 + Ala
Glu + 草酰乙酸 α-酮戊二酸 + Asp
这类反应是由氨基移换酶催化而成。
3、微生物经氨化作用或经固氮作用生成的氨可以通过特定的反应来吸收生成新的氨基酸（氨同化作用）
α-酮戊二酸+NH3 谷氨酸脱氢酶 Glu +水
NH3+ATP Glu á-KD、PY、OA
Gln合成酶 转移酶
ADP+Pi Gln Glu、Ala、Asp
4、从前体合成氨基酸。
按前体不同可将20种氨基酸为六组：
（一）3-磷酸甘油醛：丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸
（二）4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸：色氨酸、 酪氨酸、苯丙氨酸
（三）丙酮酸：丙氨酸,亮氨酸、缬氨酸
（四）α-酮戊二酸：谷氨酸、谷酰氨 脯氨酸、精氨酸、赖氨酸（真菌中）
（五）草酰乙酸：天冬氨酸 天冬酰氨 甲硫氨酸 苏氨酸 异亮氨酸 赖氨酸（细菌）
（六）5-磷酸核酮糖+ATP：组氨酸
初生氨基酸：Ala, Glu, Asp, Gly，氨基化所生成的氨基酸。
次生氨基酸：以初生氨基酸为前体合成。
工业生产氨基酸
最初利用蛋白质水解法生产，1957年开始用发酵法生产。近年采用生化合成法：
1、酶转化法
反丁烯二酸+NH3 Asp酶 L-Asp
丙酮酸+NH3+苯酚 Tyr酶 Tyr
2、完整细胞酶合成：选用酶活力高菌种，处理菌体使物质易透过。
DL-Ser+丙酮酸+苯酚 菌体 L- Tyr
丙酮酸+ NH3+吲哚 菌体 L-Trp
4节：代谢调控
代谢—生化反应—酶催化—基因编码→基因调控
↓
环境因子影响 环境调控
代谢调节部位：真核和原核
合成调节：诱导合成、终产物阻遏、分解代谢物阻遏
酶
活性调节：反馈（终产物）抑制、酶活性共价修饰
一、主要调节机制
（一）酶的诱导合成
Karstrom 适应酶 Monod 诱导酶
组成酶 Cohn 组成酶
诱导剂不一定是底物，但底物大多数情况下是有效诱导剂。
诱导酶只在有诱导剂时才合成，除去诱导剂就停止。是全新合成，而不是原有酶的激活。
某些酶的诱导物
操纵子学说
Monod & Jacob, 1962
调节基因 操纵子
P R t P O z y a t
mRNA RNA多聚酶
无诱导物时，结合。
阻遏物 有诱导物时，脱落。
（二）终产物阻遏（反馈阻遏）
主要在合成代谢途径中，终产物或其衍生物对该途径上一个或多个酶形成的抑制作用。
如E. coli Met, Arg的合成。
机制：调节基因 原阻遏物（阻遏物蛋白）
与终产物结合时被激活，与操纵基因结合，阻止结构基因转录。终产物为辅阻遏物。属于正调节。
（三）分解代谢物阻遏（葡萄糖效应）
Monod研究E. coli 对混合碳源利用，发现葡萄糖抑制其它糖利用，出现二次生长。
所有迅速代谢能源都能阻抑较慢代谢的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。此称葡萄糖效应。
酶大多数是诱导酶。
葡萄糖效应并不是由葡萄糖直接造成，而是葡萄糖某种分解代谢物引起。
cAMP（环腺苷酸）是关键控制因子。
其与分解代谢物活化蛋白（CAP）结合，促使RNA多聚酶与启动基因结合而开始转录。 cAMP浓度低时，影响结合，不能转录。
葡萄糖的某种代谢产物降低了cAMP水平，即使有诱导剂存在，也不能合成分解其它糖的酶，只有葡萄糖消耗完， cAMP水平上升，才能开始转录、合成。
ATP 腺苷酸环化酶 cAMP 磷酸二酯酶 AMP
（四）反馈抑制
1、协同反馈抑制：终产物不能单独抑制，要几个终产物同时作用，合作抑制。如多粘芽孢杆菌的Asp族氨基酸合成。6-53
2、合作反馈抑制：两种终产物同时存在，起着比一种大得多的抑制。 图6-54
3、同工酶：多个酶催化同一个反应，分别受不同终产物抑制。图6-51
如大肠杆菌的Asp族氨基酸合成，图6-52
4、顺序反馈抑制：代谢途径中第一个酶不受终产物抑制，而受分支处中间产物抑制，终产物抑制引起中间产物积累，从而抑制第一个酶。图6-57
如红色假单胞菌的Ile合成。
5、积累反馈抑制：每一个终产物单独、部分地抑制共同步骤的第一个酶，互不影响。图6-55
如大肠杆菌的Gln合成酶受8个终产物抑制。图6-56
调节位点（变构中心）
反馈抑制机制：变构酶
底物位点（活性中心）
（五）酶活性共价修饰
由一个修饰酶（活化酶）催化另一种酶起共价修饰的改变，从而改变后者活性。
酶-X 酶 + X （X：小分子化合物）
修饰酶
如大肠杆菌Gln合成酶：AMP与酶共价结合时（腺苷酰转移酶催化）活性低，脱去AMP，活性高。
胶质假单胞菌柠檬酸裂解酶：乙酰化（有活性），脱乙酰化（无活性）
二、代谢调控应用
(一）在初级代谢产物生产上应用
反馈调节最重要，要绕过，方法如下：
1、降低末端产物浓度（应用营养缺陷型解除正常反馈调节）
单线途径：应用营养缺陷型积累中间代谢物，采用低浓度终产物供给。
Ea Eb Ec
A B C D E
Ec 缺失，积累C，低浓度供给E。
分支途径：积累末端产物。
E1 F G
A B C D E
E2 H I
E1缺失，限制I，少量E→G，大部分分泌。
Lys生产：高Ser缺陷型，图6-62
肌苷酸生产：腺嘌呤缺陷型，图6-63
2、筛选抗反馈突变株（解除反馈）
在含有抗代谢物的培养基中培养，筛选抗性突变株，其中一些可分泌大量末端产物。如对氨基Phe/Tyr, 7-氮杂Trp/Trp
3、控制细胞膜渗透性
通过生理学或遗传学方法，改变膜透性，使胞内代谢物迅速渗漏到胞外，解除反馈抑制。
（二）在次级代谢产物生产上应用
次级代谢产物通常在细胞生长后期形成，主要是抗生素、毒素、甾体化合物等。在自然条件下，微生物产生次级产物能力一般不高，其生产也受代谢调控。
可通过诱变育种和控制环境条件来提高产量，但次级产物合成途径比较复杂，许多还不清楚，因此关于次级产物合成的确实控制部位还大多不明。
青霉素生产中，葡萄糖虽能很好利用，但生产不适宜，而乳糖虽缓慢利用，却可多产青霉素。在含葡萄糖和乳糖混合培养基中，生长阶段迅速利用葡萄糖，葡萄糖用尽时，对乳糖利用解阻遏，不生长，但产青霉素。也可利用后期流加限量葡萄糖的方法实现。
其他次级产物生产也广泛采用这种方法。另外，氮源种类、浓度对次级产物产生与积累也有很大的影响，磷酸盐也有影响
（三）在酶生产上应用
酶合成受基因和代谢物双重控制
1、加诱导剂
诱导酶只有在诱导剂存在时形成，在培养基中加入诱导剂。要注意底物诱导剂的浓度。
2、降低阻遏物浓度
参与分解代谢的酶，通常受诱导和阻遏双重控制，包括终产物阻遏和分解代谢物阻遏。为了大量生产酶，要避免使用丰富，复杂培养基，不要含快速利用的糖类。合成酶类通常被终产物阻遏，要对产生阻遏的化合物加以限制。
3、利用突变产生不需诱导物或不受阻遏的突变体
（1）生长在低浓度诱导物中选育不需诱导剂的组成性突变株。
（2）利用抗代谢物，筛选不受终产物阻遏的突变体。
（3）利用被阻遏的酶的底物作唯一的碳源，可筛选不受分解代谢物阻遏的突变体。
4、增加基因模板
将外源特异基因导入微生物体内，增加酶产量。
（1）游离基因转移法
（2）phage转导法
