ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网


② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程

      P288  图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程

第一阶段  酰化
Ser195¬--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段  脱酰
电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。

除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。

P288  图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位

        胰凝乳蛋白酶          胰蛋白酶          弹性蛋白酶
可供芳香环及大     可供带电荷的    只能让Ala等小分子
的非极性侧链伸入    Lys.、Arg进入        进入
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、 多酶体系
（一） 多酶体系及其分类
细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
     P297 图4—42（分散性的多酶体系）  图4-43 （多酶复合体）
（二） 多酶体系的自我调节
（1）大部分具有自我调节能力的多酶体系，第一步反应就是限速步骤，它控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活
催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活

P299   图4-45反馈抑制与底物激活

正调节物：一般是别构酶的底物，可以激活别构酶。
负调节物：可以抑制别构酶，一般是代谢序列的最终产物。
通过多酶体系的自我调节（反馈抑制和底物激活），可使代谢过程得以协调地、有条不紊地合理进行。
下面讨论具体到每个酶是怎样调节的
二、 酶活性的调节控制和调节酶
调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。
（一） 别构效应的调控
别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。
（1）、 别构酶的结构特点和性质
（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基
（2） 具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
（3） 多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
（4） 别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。
（2）、 别构酶的动力学曲线
① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线
P303  图4-46   4-47

这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。

当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。
② 同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线
P304图4-48
负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感
（3）、 别构酶调节活性的机理
① 序变模型：
酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。
② 齐变模型：
（4）、 别构酶的鉴定
① S型曲线是必要但不充分条件
② 脱敏作用
③ [S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正协同
Rs＞81 负协同
④ Hill系数法
（二） 可逆共价修饰的调控（共价调节酶）
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶 
P313  图4-57

信号的级联放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G
共价调节酶的两种常见类型
①磷酸化         去磷酸化     -OH  ATP
②腺苷酰化        脱腺苷酰化  腺苷酰基由ATP提供
（三） 酶原的激活
具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
（1）、 胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）

P314    图4-58
（2）、 胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活
                 肠激酶
              胰蛋白酶原       胰蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原                弹性蛋白酶原
                       胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶                  弹性蛋白酶
                羧肽酶原        羧肽酶
（四） 专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制
钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特异的酶活性
第六节 酶与抗体——抗体酶 abzyme(antibody enzyme)
参阅 P293
又称催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。
过渡态理论：酶与底物不是在基态，而是在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
而抗体与抗原是基态结合。

第七节 同工酶、诱导酶
1、 同工酶
能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。
哺乳动物乳酸脱氢酶有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+  LDH   CH3COCOO-+NADH+H+
均由4个亚基组成
HHHH     在心肌中占优势
HHHM
HHMM
HMMM
MMMM   在骨骼肌中占优势
2、 诱导酶
酶可相对地区分为结构酶和诱导酶。
结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
如：大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培养基中
E.coli在只含乳糖的培养基中：Glc-β(1→4)Gal苷
第八节 酶工程

第三章     蛋白质

第一节 蛋白质概论
蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。
一、 蛋白质的化学组成与分类
1、 元素组成
碳 50%  氢7%    氧23%   氮16%    硫 0-3%    微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼
凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25
2、 氨基酸组成
从化学结构上看，蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子。
3、 分类
（1）、 按组成：
简单蛋白：完全由氨基酸组成
结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基）
详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。
（2）、 按分子外形的对称程度：
球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。
纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。
（3）、 功能分：
酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。
4、 蛋白质在生物体内的分布
          含量(干重)  微生物     50-80%
                       人 体    45%
                    一般细胞    50%
              种类  大肠杆菌    3000种
                       人体     10万种
                     生物界     1010-1012

二、 蛋白质分子大小与分子量
蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。

P 76 表3-3    （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。）

蛋白质分子量= aa数目*110
对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。
三、 蛋白质分子的构象与结构层次
蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。

P77 图3-1，蛋白质分子的构象示意图。

一级结构    氨基酸顺序
二级结构   α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲
三级结构   α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段
四级结构   多亚基聚集
四、 蛋白质功能的多样性
细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。
1． 酶
2． 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）
3． 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4． 物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）
5． 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6． 激素功能（胰岛素）
7． 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）
8． 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9． 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）
第二节 氨基酸
一、 蛋白质的水解(见P79)
氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。
酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基
碱水解：消旋，色氨酸稳定
酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能：
（1）、 组成蛋白质
（2）、 一些aa及其衍生物充当化学信号分子
-aminog butyric acid -氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。g(
Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroid gland产生的Tyr衍生物)和吲乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。
（3）、 氨基酸是许多含N分子的前体物
核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa
（4）、 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物
精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是排除它们的一种重要机制。
三、 氨基酸的结构与分类
1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150种)。
（一） 编码的蛋白质氨基酸（20种）
也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。
近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白质氨基酸。

结构通式：
不变部分，可变部分。L-型，羧酸的α-碳上接-NH2，，所以都是L-α-氨基酸。

α-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在200℃以上。
除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。

表  20种氨基酸结构
1、 按照R基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）：
（1）、 R为脂肪烃基的氨基酸（5种）
Gly、Ala、Val、Leu、Ile、
图3-2

R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03）

P 92 表 3-7   （比较等电点。）

Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。
从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile 是这20 种a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3以外）。
（2）、 R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
含羟基的有两种：Ser和Thr。
图3-3

Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。
Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。
Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。
含硫的两种：Cys、Met
图3-4

Cys中R含巯基（-SH），Cys 具有两个重要性质：
（1）在较高pH值条件，巯基离解。
（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。
Cys—s—s—Cys
二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。
Cys还常常出现在酶的活性中心。
Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。
 Cys与结石u
在细胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。
胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结石会导致疼疼、发炎甚至尿血。
大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。
青霉胺的结构
（3）、 R中含有酰胺基团（2种）
Asn、Gln
图3-5

酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义
（4）、 R中含有酸性基团（2种）
Asp、Glu，一般称酸性氨基酸
图3-6

Asp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25
它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。
（5）、 R中含碱性基团（3种）
Lys、Arg、His，一般称碱性氨基酸
图3-7

Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）
Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。
His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。
His含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。
（6）、 R中含有芳基的氨基酸（3种）
Phe、Try、Trp
图3-8
都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer  complex)或电子重叠复合物。在受体—底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。
这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，Trp＞Tyr＞Phe。
Phe疏水性最强.。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解。
Trp有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。
（7）、 R为环状的氨基酸（1种）
Pro，有时也把His、Trp归入此类。
图3-9

Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，
 必需氨基酸：u
成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe
婴儿期：Arg和His供给不足，属半必须氨基酸。
必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸）
2、 按照R基的极性性质(能否与水形成氢键)20种基本aa，可以分为4类：
侧链极性(疏水性程度)
Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0
Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0
Met 1.3 Gln -0.2   His 0.5
Pro 1.4 Thr 0.4   
Val 1.5 Cys 1.0   
Leu 1.8 Tyr 2.3   
Ile 1.8     
Phe 2.5     
Trp 3.4     
（1）、 非极性氨基酸
9种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸的R基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。
（2）、 不带电何的极性氨基酸
6种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。
酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，Asn和Gln的-NH2很容易形成氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。
（3）、 带负电荷的aa(酸性aa)

2种，在pH6~7时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何。
（4）、 带正电何的aa(碱性aa)
3种，Arg、Lys、His。在pH7时带净正电荷。
当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱，在pH7时约10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。
酶的活性中心：His、Ser、Cys
非极性aa一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。
（二） 非编码的蛋白质氨基酸
也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。
-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。gProthrombin(凝血酶原)中含有
结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
图3-10  修饰aa的结构

（1）4-羟脯氨酸     

（2）5-羟赖氨酸    
这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。

（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）   

(4)г-羧基谷氨酸                 
存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。

（5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中）
（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。
（三） 非蛋白质氨基酸
除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。
（1）L-型α –氨基酸的衍生物
L-瓜氨酸
图

L-鸟氨酸
图
（2）D-型氨基酸
D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）
（3）β-、γ-、δ-氨基酸
β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。
四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收
1、 氨基酸的构型
除Gly外，19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr和Ile的β-碳原子也是不对称的，因此Thr、Ile各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体。


图 P86   L-苏氨酸    D-苏氨酸    L-别一苏    D-别-苏

构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。
2、 旋光性
20种氨基酸中，只有Gly无手性碳。Thr、Ile各有两个手性碳。其余17种氨基酸的L型与D型互为镜象关系，互称光学异构体（对映体，或立体异构体）。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一））。另一个异构体可使偏振光顺时针旋转（计为（+）），称为旋光性。