① 同聚加尾法 形成 “粘性末端”
② 衔接物(linker)连接：在平末端DNA两段加衔接物，再用相应的酶酶切，得到粘性末端
③ DNA接头(adapter)连接法：用T4连接酶间接DNA接头，使DNA具有粘性末端。
（3）PCR产物的连接
① 在引物的5’端设计酶切位点：得到两端带有酶切位点的PCR产物，然后用相应的酶酶切，两头各有一个粘性末端。
②与T载体直接连接：用Taq DNA聚合酶
2.感受态
Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
3.重组DNA转入大肠杆菌的方法
（1）转化（transformation）：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入大肠杆菌的过程。
（2）转染（transfection）:以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入大肠杆菌的过程。
（3）转导（transduction）:以噬菌体作为媒介讲一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体）的过程。
4.重组DNA导入植物细胞的方法
① 叶盘法（leaf disk)：由根癌农杆菌介导（agrobacterium tumefaciens ） （Horsch 等,1985）：根癌农杆菌中存在Ti质粒，将外源基因插入Ti质粒后构建的重组Ti质粒转化土壤农杆菌，后者是植物的易感菌，与叶盘共培养后可进入植物。
② 电击法（electroporation)：短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差使细胞穿孔，使DNA扩散进细胞。
③ 基因枪法（gene gun）又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)
5.重组DNA导入哺乳动物细胞的方法
① 磷酸钙沉淀法
     原理：磷酸盐缓冲液与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀，后者吸附到细胞膜表面，被内吞。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。
      特点：不需要载体。
② 脂质体（lipofectin）载体法
     脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。
     脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）
③ 显微注射法(microinjection)
     直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。
④DEAE-葡聚糖传染法：二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
第七章 重组子的筛选和鉴定
1.重组子的筛选和鉴定
重组子的筛选和鉴定是方法：
（1）    抗药性标记插入失火选择法、β-半乳糖苷酶显色反应选择法以及根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法等遗传检测法。
（2）    凝胶电泳检测法和R-环检测法等物理检测法
（3）    Southern印记杂交、northern杂交、原位杂交等核酸杂交法
（4）    放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免疫化学法
（5）    DNA-蛋白质筛选法
2.抗药性标记插入失火选择法、β-半乳糖苷酶显色反应选择法以及根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法等遗传检测法。
抗药性标记插入失火选择法：
（1）四环素抗性插入失活
         如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素+环丝氨酸平板培养基选择重组克隆—— 
       Tetr 失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
       Tetr 不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
（环丝氨酸杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌）
（2）氨苄青霉素抗性插入失活
         如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。（挑选蓝色克隆）
β-半乳糖苷酶显色反应选择法：
β-半乳糖苷酶使Xgal分解成蓝色产物。插入外源基因失活，不能分解，挑选白色克隆。
根据插入序列的表型特征选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
原理：（1）弥补缺陷 （2）增加新性状
3.凝胶电泳检测法和R-环检测法等物理检测法
凝胶电泳检测法：
（1）    直接电泳检测法：从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳，比较其分子量。
（2）    酶切电泳筛选法：将外源DNA酶切下，进行电泳，有插入的载体和对照载体比较。
（3）    PCR扩增检测法
R-环检测法：DNA-RNA杂交，电镜下课间一种R-环形结构
4．Southern印记杂交、northern杂交、原位杂交等核酸杂交法
Southern印记杂交：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。  
northern杂交：
•   用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。
     •   从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。
     •   主要检测插入片断是否被转录  
原位杂交：直接将菌落(噬菌斑)原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。溶菌(噬菌斑)变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落(噬菌斑)
5.放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免疫化学法
放射性抗体测定法：
将菌落或噬菌体转移到硝酸纤维素滤膜上，然后复制平板，经氯仿蒸汽溶菌、气溶胶溶噬菌斑后，将待检蛋白转移到已结合一抗的硝酸纤维素滤膜上，然后浸泡到二抗溶液中，结合二抗，清洗滤膜，放射自显影，曝光后与原始平板对比菌落或噬菌体。
免疫沉淀测定法：非放射性抗体检测分泌型产物。在含抗体的平板培养基，表达外源基因的菌落形成沉淀圈。对于不能分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
6.DNA-蛋白质筛选法
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。将待检蛋白质与硝酸纤维素滤膜连接，然后与带有放射性标记的能与蛋白质结合的DNA序列相连接，然后检测。
7.重组体筛选与鉴定的具体方法的过程及原理。
第八章 外源基因表达系统
1.基因工程受体种类、各自优缺点
•    限制性缺陷型       避免修饰和降解
   外切酶和内切酶活性缺陷（recB-/recC-/hsdR-） 
•    重组整合缺陷型　避免重组整合
      用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
•    感染寄生缺陷型　防止感染
      防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
•    具有较高的转化效率　较高的可转化性
•    具有与载体选择标记互补的表型　利于筛选
2.原核生物基因表达的特点
•    只有一种RNA聚合酶：识别原核细胞启动子，催化所有RNA合成。
•    以操纵子为单位：数个相关结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。
•    转录和翻译偶联、连续进行。
•    不含内含子，缺乏转录后的加工系统。
•     调控主要在转录水平上。
•     mRNA的核糖体结合位点（rbs, SD）
      Shine-Dalgarno（S-D）sequence：含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列。
3.外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件：启动子、S-D序列、终止子、衰减子等原核生物基因表达序列
启动子：DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）：-35 Box 和 -10 Box
基因工程常用的原核启动子（最佳启动子必须具备的条件）：
•   必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。
•   应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白等。
•       应是可诱导型的，用温度或化学试剂诱导。
•       Plac、Ptrp、PL、PrecA

S-D序列：核糖体结合位点（RBS），mRNA上与核糖体16sRNA结合是序列。影响外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达。
终止子：终止外缘基因在强启动子的控制下表达。
衰减子 :衰减发生处的一种内部终止子序列。衰减子是位于细菌操纵子上游的一段核苷酸序列。原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式称衰减作用。
4.包涵体表达、分泌型表达、融合型表达等原核表达各自优缺点
外源基因在大肠杆菌中表达形式：
（1）    包涵体型异源蛋白的表达
（2）    分泌型异源蛋白的表达
（3）    融合型异源蛋白的表达
（4）    寡聚型异源蛋白的表达
（5）    蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
优点：
•    能简化外源基因表达产物的分离操作
   包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
•    能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
   重组异源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性主要取决于包涵体形成的速度。在形成包涵体之前，由于二硫键的随机形成以及肽链旁侧基团修饰的缺乏，异源蛋白的蛋白酶作用位点往往裸露在外，导致对酶解作用的敏感性。
缺点：
（1）以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。
（2）然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
分泌型表达：外源基因产物通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。
优点：
目的蛋白稳定性高    重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳稳定性大约是在细胞质中的10倍。
目的蛋白易于分离   
目的蛋白末端完整    相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。
缺点：
（1）    相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。
（2）外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。
融合型表达：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。
优缺点：
•    目的蛋白稳定性高    尤其对分子量较小的多肽效果更佳
•    目的蛋白易于分离    利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白
•    目的蛋白表达率高    与受体蛋白共用一套完善的表达元件
•    目的蛋白溶解性好    由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性
•    目的蛋白需要回收    融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段
5.提高克隆基因表达效率的途径
（1）优化表达载体的设计：在构建表达载体时对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA互补配对的氨基序列等。
（2）提高稀有密码子tRAN的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用同义密码子的频率不同。
（3）提高外源基因mRNA的稳定性。尽可能减少核酸外切酶可能对mRNA的降解或改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解。
（4）提高外源基因表达产物的稳定性。降低水解酶对外源基因表达产物的降解。
（5）优化发酵过程。在工艺方面和生物学方面进行优化。
6.在酵母细胞中克隆基因常用的载体有YIp、YRp、Yep
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
YRp：以ARS为复制子的质粒。
Yep：以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为Yep
含有CEN的YCp质粒的构建
•    CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列
•    将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp
•    YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
•    在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。
•    目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域.
7.植物基因克隆中常用的载——Ti质粒
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。
Ti 质粒的图谱
整个质粒 160 - 240 kb
其中 T-DNA 12 - 24 kb
tms 的编码产物负责：合成吲哚乙酸
tmr 的编码产物负责：合成植物分裂素
tmt 的编码产物负责: 合成氨基酸衍生物   冠瘿碱
8.动物细胞基因克隆中SV40等载体
•    动物细胞基因克隆和表达载体---SV40病毒常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40 （simian  vacuolating virus40）改造而来的。
•    SV40 DNA载体只保留SV40的复制起始区（ori）、早期区域（T抗原）的启动子、Poly A等。
SV40 DNA载体的特点
•    基因表达好  外源基因能高效表达
•    基因重排高  病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
•    宿主范围窄  只能转染猴细胞
•    装载量较小

9.营养缺陷型的哺乳动物受体细胞筛选原理
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。
含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补
10．常用的高等哺乳动物细胞受体CHO\Cos
中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：
•    遗传背景清楚，生理代谢稳定
•    与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确
•    基因转移和载体表达系统完善
•    耐受剪切力，便于大规模培养
•    被美国FFDA确认为安全的基因工程受体细胞 （GRAS）
COS细胞
•     用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的，所以称COS（CV-1，Origin, SV40）
•    COS细胞的特点：
•  有SV40的T抗原。有利于SV40来源的载体复制（ T抗原
    的功能是促进DNA双链的解链）。
•  病毒不能复制。
•  DNA整合到染色体上。
11.整株植物的再生性
植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，放在含有合适营养和植物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。
愈伤组织的细胞分化取决于植物生长素（Auxins）和分裂素（Cytokinins）的相对浓度。生长素与分裂素之比高，则根部发育；生长素. 与分裂素之比低，则茎部发育。
植物细胞通常不能有效地吸收外源DNA，因为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成培育出整株植物。
这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。
基因治疗
1.基因治疗：是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。
2.基因治疗的策略
（1）基因置换：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。
（2）基因添加：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
（3）基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
（4）自杀基因治疗：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。
（5）基因免疫治疗：通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 
（6）耐药基因治疗：耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。
3.基因治疗的途径
①ex vivo 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；
②in vivo 途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。
RNA 干扰
1．    miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-25个核苷酸组成的单链RNA（3'端可有1-2个碱基长度的变化）。
2．    miRNA与靶mRNA的作用模式
1）二者不完全互补，即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4
2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171
3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7 果蝇/线虫
3. RNA 干扰
RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA   (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。
它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。
4. RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默
较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。
高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。
可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。
5.RNAi应用
基因治疗：RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。
肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。
研究基因的功能：由于RNAi 可以特异性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究（类似Gene knock out)。
防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用 。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。